Halofilik Halomonas smyrnensis AAD6`da quorum sensing mekanizmasının araştırılması

Abstract

Halomonas smyrnensis AAD6 suşu, oldukça değerli bir biyopolimer olan levan'ıyüksek miktarda ürettiği çalışma grubumuzca saptanan ılımlı halofilik karakterdeGram negatif bir bakteri suşudur. Quorum sensing ise pek çok farklı çalışmagrubu tarafından polimer üretimi, antibiyotik sentezi, virülens faktörlerinsalınması, biyofilm oluşumu, kompetans gibi çok önemli süreçleri regüle ettiğibildirilen bir sinyal mekanizmasıdır ve 100 den fazla bakteride varlığıgösterilmiştir. Bu veriler ışığında Quorum sensing mekanizmasının elemanlarınınaraştırılması ve bu elemanlar ile levan üretiminden sorumlu olan levan sükrazgeni (sacB)'nin farklı koşullardaki ifadelenme profillerinin olası bir parelelliğinvarlığı açısından araştırılması bir gereklilik haline gelmiştir. Gerçekleştirilençalışmalarda, AAD6 suşundan elde edilen ve hücre içermeyen süpernatantlarındiklorometan özütleri, A.tumefaciens NTL4 raportör suşu varlığında; ince tabakakromatografisini takip eden soft agar overlay tekniği ve nihayetinde LC-MS-MSkullanılarak, bilinen Gram negatif quorum sensing sinyal molekülleri varlığıyönünden taranmıştır. Bu çalışmalar sonucunda AAD6'nın sinyal molekülüolarak diğer Gram negatif bakterilerin kullandığı sinyal molekülleriyle aynı sinyalailesine dahil bir sinyal kullandığı ve yapısının 16 karbonlu bir açil homoserinlakton olduğu saptanmıştır. Anotasyon çalışmaları ise, quorum sensinggenlerinden luxS, luxP ve luxR genlerinin varlığına delil olabilecek bulgular eldeedilmiştir. Gerçekleştirilen ekspresyon çalışmalarında ise, türler arası haberleşmesinyalinin sentezinden sorumlu luxS geninin, levan üretiminden sorumlulevansükraz geni ile oldukça benzer bir ifadelenme profiline sahip olduğuanlaşılmıştır. Benzerliğin, iki genin birlikte regüle olduğunu düşündürecekdüzeyde olduğu ortaya çıkmıştır. Buna göre her iki gen de maksimum olarak,inokülasyonu takiben ilk 24 saat içinde eksprese olmaktadır. Quorum sensingmekanizması ile levan üretimi arasındaki ilişkinin eksiksiz olarak ortayaçıkarılması için ise ek deneylere ihtiyaç duyulduğu ortaya çıkmıştır.

Halomonas smyrnensis AAD6, is a moderate halophilic Gram negative bacteriumthat proved to be producing high levels of levan, a precious polymer, by ourresearch group. Polymer and antibiotic synthesis, secretion of virulence factors,biofilm formation, competence are some of crucial phenotypes reported to beregulated via specific and common, , signaling pathway called Quorum sensingfor more than 100 bacteria species. For these reasons, it becomes a necessity toexplore AAD6's quorum sensing mechanism's metabolic and genetic elementsand their relations with levan synthesis. Cell free supernatants from strain AAD6extracted with dichloromethane, analyzed via thin layer chromatography followed by LC/MS-MS andtested for known signals of acyl homoserine lactones by using soft agaroverlay which contains Agrobacterium tumefaciens NTL4 reporter strain. Thesestudies showed that AAD6 employs the typical signal family, acyl homoserinelactones family, same as other Gram negative bacteria and besides its chemicalstructure is proved to be a C16 acyl homoserine lactone. Genome annotationstudies via RAST annotation server, showed the existence of luxS, luxP, andsome possible luxR genes in AAD6 genome. Gene expression studies indicatedsuch highly similar expression pattern for luxS and sacB genes that it lead us tohypothesize that these genes are being regulated together. Both of the genes areexpressed at their maximum level, during the first 24 hour following inoculation.It is well understood that additional experiments needs to be conducted to clarifythe quorum sensing mechanism and its relation with levan biosynthesis in detail.