Tetrahymena thermophila`da afinitik takılı insan büyüme hormonu`nun tetrahymena yapay koromozom vektör altyapısı ile rekombinant üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

Abstract

Ülkemizin 2023 hedefi, sağlık alanında ilaç üretim altyapısının yetişmiş insan ve şirketleşme ile oluşturulmasıdır. Bu tez kapsamında; alternatif protein üretim konakçısı Tetrahymena thermophila'da insan terapötik proteinlerinden insan büyüme hormonunun (hGH) üretimi, amaçlanmıştır. hGH üretiminin vektörel altyapısında, İyi İmalat Uygulamalarına (İİU) uygun yüksek kopya sayılı dairesel T. thermophila makronükleer yapay kromozom-2 (TtAC2)'nin kullanımı planlanmıştır. TtAC2'nin ısı ile indüklenebilir HSP70.2 ısı şoku promotorunun kontrolü altına kodon uyumlu hGH kodlayıcı DNA dizileri klonlanmıştır. Biyolistik silah ile T. thermophila CU428 ırkına vektörler transforme edilmiştir. GFP-hGH füzyon proteini sitoplazmik üretimi 50 kDa monomer-101 kDA dimer, 6xHis-hGH ve takısız hGH proteinlerinin sitoplazmik üretimi ise 17 kDa-22 kDa monomer ve 34 kDa-44 kDa dimer olarak SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile gösterilmiştir. PLA22/23 sinyal peptid dizisi kullanılarak, endoplazmik retikulum üzerinden hücre dışına yönlendiren 6XHis-hGH ve takısız hGH'ın hücre dışına salgılandığı ELİZA ile tespit edilmiştir. Literatür kapsamında hipotezlenen hücre dışına salgılanan hGH'ın T. thermophila sekretom proteazları tarafından parçalandığı, in vitro proteolitik enzim aktivite testi sonuçları ile kanıtlanmıştır. Bu tez çalışması ile biyoaktivite analizleri için gerekli hGH proteinlerinin üretimi ve saflaştırılmasının vektörel altyapısı oluşturulmuştur. T. thermophila'da hGH üretim miktarının bu organizmanın proteaz genlerinin susturulması ve optimize biyoreaktör üretimiyle arttırılabileceği, sonucuna varılmıştır.

2023 National Vision plans to establish the pharmaceutical production substructure in the field of health through trained human resources and corporatization. In this thesis; human growth hormone (hGH), which is one of the human therapeutic proteins, is aimed to be produced in Tetrahymena thermophila as an alternative protein production host. The use of high copy number T. thermophila macronuclear artificial chromosome-2 (TtAC2) adapted for Good Manufacturing Practices (GMP) is planned as the vector infrastructure in hGH production. Codon-optimized hGH encoding DNA sequences were cloned into the TtAC2 vector, which is under the kontrol of the heat-inducible HSP70.2 heat shock promoter for protein expression. The vectors were transformed to the T. thermophila CU428 strain by the biolistic gun. The cytoplasmic production of the GFP-hGH fusion protein as 50 kDa monomer-101 kDA dimer, 6xHis-hGH and untagged-hGH cytoplasmic proteins as 17 kDa-22 kDa monomers and 34 kDa-44 kDa dimers were demonstrated by SDS-PAGE and Western Blot analysis. Secreted hGH was extracellularlly detected by ELISA analysis when 6XHis-hGH and untagged-hGH was produced by PLA22/23 signal peptide sequence directing the extracellular environment through endoplasmic reticulum. The literature based hypothesis about the degradation of secreted hGH by secretomic proteases has been confirmed by the results of in vitro proteolytic enzyme activity assay. In this thesis, the vector infrastructure developed for the production and purification of hGH could be used in the bioactivity characterization. As a result; the production amounts of hGH in T. thermophila can be increased by silencing protease genes of the organism and optimized bioreactor culturing.