Hipoksik iskemik beyin hasarı oluşturulmuş yenidoğan sıçanlarda trombosit uyarıcı faktör antagonisti uygulamasının bilişsel ve motor yetiler üzerine etkisinin değerlendirilmesi

Abstract

Perinatal dönemde meydana gelen hipoksik iskemik beyin hasarı (HİBH) mortalite ve süregen nörolojik hasarın başlıca nedenlerindendir. Hipoksik-iskemi ve reperfüzyon sonrasında gelişen apoptozun şiddeti (apoptotik nöron yüzdesi) serebral hasarlanmanın bir göstergesidir. HİBH' nin yeri ve genişliğine göre serebral palsi, nöbetler, öğrenme güçlükleri, görme ve işitme kaybı, motor kusurlar gibi pek çok kalıcı klinik durum gelişebilmektedir.Hipoksi ve iskemiyi takiben reperfüzyon dönemine geçmeden verilecek tedaviler ile hasarı önleme ya da azaltma mümkün olabilir. Trombosit uyarıcı faktör (platelet activating factor-PAF) antogonisti olan ABT-491 ile nöronal hasarlanmanın engellenebileceği önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Sıçanlar üzerinde yapılan bu çalışmada akut dönemde nöron hasarlanmasının önlenmesinin uzun dönemde bilişsel ve motor yetiler üzerine olan etkisi araştırıldı.Çalışmaya alınan sıçanlar üç gruba ayrıldı. Grup A (n:30) ve B (n:30)' deki sıçanlara orta hat kesisi yapılarak sağ karotid arterleri bağlandı. Bu sıçanlar %8 oksijen içeren hipoksi odacığında bir saat bekletildi. Hipoksi sonrası grup A' dakilere ABT-491 (0.4mg/kg) ve grup B' dekilere serum fizyolojik (SF) periton içi yolla (intraperitoneal, ip) verildi. Grup C' deki sıçanların (n:30) ise karotid arterleri bulundu, fakat bağlanmadı. Bu sıçanlara hipoksi de uygulanmadı (Sham grubu). Her gruptan yedi sıçan hipoksi sonrası ikinci saatte dekapite edilerek beyinde apoptotik nöron sayısı ve serum malondialdehit (MDA) düzeylerine bakıldı. Kalan sıçanların uzun dönemdeki bilişsel ve motor yetileri davranış deneyleri (artı labirent, açık alan ve Morris su tankı) ile değerlendirildi. Deneylerin bittiği 16. haftada tüm sıçanlar dekapite edilerek beyin ağırlıkları ölçüldü ve beyinleri makroskopik olarak incelendi.TUNEL ve Kaspaz-3 yöntemi ile boyanan apoptotik hücre saysının grup B' deki sıçanlarda diğer gruptakilere göre anlamlı bir şekilde fazla olduğu saptandı (p<0.001). Plazma MDA düzeyi de grup B' deki sıçanlarda daha yüksekti ancak, gruplar arası karşılaştırmada istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı.Doğumdan sonraki altıncı haftada artı labirent deneyi ile değerlendirilen öğrenme yetisinin grup B' deki sıçanlarda daha zayıf olduğu, ancak bu durumun istatistiksel olarak önemli olmadığı görüldü.Doğumdan sonraki 10. haftada lokomotor aktivite açık alan deneyi ile değerlendirildi. Grup B' deki sıçanların ortalama hareket hızları ve birim zamanda katettikleri mesafe diğer iki gruba göre daha düşük bulundu, ancak bu durumun da istatistiksel bir öneminin olmadığı anlaşıldı.Sıçanların uzak (reference) ve yakın (working) hafıza yetileri Morris su tankı deneyleri ile sırasıyla 12 ve 14. haftalarda değerlendirildi ve gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmadı.Deneyin sonlandırıldığı 16. haftada en düşük ortalama beyin ağırlığı grup B' deki sıçanlarda saptandı, ancak gruplar arası karşılaştırma sonuçları istatistiksel açıdan anlamlı bulunmadı.Sonuç olarak oluşturduğumuz hipoksi-iskemi modelinde bir saatlik hipoksinin sıçanların beyninde nöronal apoptozu artırarak hasar oluşturduğu, akut dönemde oluşan bu hasarın bir PAF antagonisti olan ABT-491 uygulaması ile azaltılabildiği gösterildi. Ancak görece kısa olan bu hipoksik sürecin uzun dönemde sıçanların öğrenme, lokomotor aktivite, uzak ve yakın hafıza yetilerini önemli ölçüde bozmadığı anlaşıldı. Benzer deneylerin daha uzun süreli (örneğin iki saat) hipoksi uygulamasından sonra tekrarlanması ve ABT-491' in bilişsel ve motor yetiler üzerine olabilecek muhtemel etkilerinin değerlendirilmesinin gerekli olduğu kanısına varıldı.Anahtar kelimeler: ABT-491, apoptoz, hayvan davranış deneyleri, hipoksik iskemik beyin hasarı.

Hypoxic ischemic brain injury (HIBI) is one of the leading cause of acute mortality and chronic neurologic damage in neonatal period. Transient and permanent clinical situations such as cerebral palsy, seizures, difficulty of learning occurs depending the location and severity, of HIBI.Interventions before the reperfusion period may ameliorate the harmful effects of hypoxia and ischemia. ABT-491, a highly potent and selective platelet activating factor (PAF) antagonist was shown to be beneficial in decreasing [neuronal damage (cell death and apoptosis)] after hypoxic-ischemic insult.The aim of this study was to evaluate the effect of ABT-491 (0.4mg/kg) on long term cognitive and motor functions in a neonatal rat model of HIBI.Seven-day-old Wistar rats were subjected to right common artery ligation and hypoxia (92% nitrogen and 8% oxygen) for one hour. They were treated either with ABT-491 (n: 30) or saline (n: 30) immediately after hypoxia. In sham group (n: 30), neither ligation nor hypoxia were performed. Seven rats from each group were sacrified at two hours after hypoxia to evaluate neuronal apoptosis and measure plazma malondialdehid (MDA) levels [neuronal apoptosis was evaluated by the terminal-transferase mediated dUTP biotin nick-end-labeling (TUNEL) and caspase-3 staining methods]. Cognitive and motor functions were evaluated by using elevated plus maze, open field arena and Morris water maze settings. At the end all rats were sacrified and brains were evaluated macroscopically.The number of apoptotic neurons in saline group was significantly higher compared to groups (p<0.001). The mean plasma MDA level was higher in hypoxic rats treated with saline, but the difference between the groups was not significant.Learning ability at six weeks, loco-motor activity (movement speed and total distance) at 10 week, reference and working memory functions at 12-14 weeks were weaker among rats in saline group compared to rats in ABT-491 and sham groups, but the differences did not reach statistically significance.İn conclusion this study showed that neuronal apoptosis was dimished by ABT-491, administered soon after hypoxic-ischemic insult. We believe this relatively short period of hypoxia (one hour) caused mild HIBI which did not cause significant deterioration in learning, locomotor and memory functions. Further studies with longer periods of hypoxia (i.e: 2 hours) should be planned to evaluate possible effects of PAF antagonists on cognitive and motor functions after hypoxic-ischemic insult.Keywords: ABT-491, animal behavioral tests, apoptosis, hypoxic ischemic brain injury.