İnsan eritrositlerinde Rho/Rho-Kinaz sinyal ileti mekanizmasının fonksiyonel önemi

Abstract

Eritrositlerin mikrokapillerlerden geçerek oksijeni taşıyabilmeleri onların deformabilite yetenekleri sayesinde olmaktadır. L-arginin/NO yolağı, sAMP ve sGMP, çeşitli protein kinazlar gibi birtakım sinyal yolaklarının ve ikinci mesajcılarıların eritrosit deformabilitesinde rol aldıkları bilinmektedir. Eritrosit deformabilitesinin, kalıtsal eritrosit membran hastalıklarında, orak hücre anemisi ve talasemiler gibi hemoglobinopatilerde de azaldığı bildirilmektedir. Ancak düz kas ve kas olmayan hücrelerde hücre şekil değişiklikleri, aktin hücre iskeleti reorganizasyonu gibi olaylara katkısı olan Rho/Rho-kinaz yolağının eritrositlerdeki fonksiyonel önemi tam olarak ortaya konmamakla birlikte eritrositlerin deformabilite bozukluğuna katkısı da bilinmemektedir. Bu çalışmada, eritrositlerde Rho/Rho-kinaz sinyal ileti mekanizmasının fonksiyonel önemini ve orak hücre anemisinde deformabilite bozukluğuna katkısını inceledik.Bu amaçla sağlıklı donör eritrositlerinde, RhoA ve Rho-kinaz (ROCK-2) enzim ekspresyonları Western-blot yöntemi ile araştırıldı. Rho aktivatörü olduğu bilinen lizofosfatidik asit (LPA, 10-5 M) ve sfingozin 1 fosfat (S1P, 10-6 M) varlığında ve yokluğunda, bazal ve mekanik stres ile indüklenmiş şartlarda ROCK enzim inhibitörleri Y-27632 ve fasudil'in (10-7-10-4 M) eritrositlerin deformabilitelerine etkisi LORCA ektasitometre ile değerlendirildi. İlaveten, LPA ve mekanik stres deneylerinde RhoA aktivasyonları, kolorimetrik G-LISA aktivasyon kiti ile ölçüldü. Ayrıca orak hücre anemili hastaların eritrositlerinin, Y-27632 (10-7-10-4 M) varlığında ve yokluğunda deformabiliteleri ölçüldü ve sodyum-metabisülfid ile indüklenen eritrosit oraklaşması üzerine Y-27632'nin etkisi, mikroskobik fotoğraflama yöntemi ile hücre sayımı yapılarak değerlendirildi.Western-blot analizi ile eritrositlerin RhoA ve ROCK-2 proteinlerini eksprese ettiğini gösterildi. LPA (10-5 M) eritrosit deformabilitesini bozarken, GTP-RhoA düzeylerini azalttı. ROCK inhibitörleri, Y-27632 ve fasudil (10-7-10-4 M), ise tek başlarına deformabiliteyi bozarken, LPA'in deformabilite bozucu etkisine ilave bir katkı yapmadı. Bir başka membran lipidi S1P (10-6 M) eritrosit deformabilitesini değiştirmedi. Subhemolitik mekanik stres, eritrosit deformabilitesini ve RhoA protein aktivasyonlarını azalttı. Ancak mekanik stres ve ROCK inhibitörleri kombinasyonu ilave bir bozukluk oluşturmadı. Orak hücre anemili donörlerde ise eritrosit deformabiliteleri, sağlıklı donörler ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak azaldı ancak, Y-27632, orak hücreli eritrositlerin deformabilite değerlerinde herhangi bir değişiklik oluşturmadı. Öte yandan, hasta eritrositlerinin sodyum metabisülfid ile indüklenen oraklaşma oranlarını 10-7 M konsantrasyonda Y-27632, 30. dakikada arttırırken daha yüksek konsantrasyonlarda ve farklı sürelerde (15, 60, 90. dakikalarda) oraklaşma yüzdelerini değiştirmedi.Bulgularımız, indirekt olmakla beraber, Rho/ROCK yolağının insan eritrositlerinde deformabiliteye katkı sağlayabileceğine işaret etmektedir. Diğer taraftan ROCK enzim inhibisyonunun, orak hücre anemisi olan hastalardan elde edilen eritrositlerin deformabilitesine ve oraklaşma oranlarına etkisinin olmadığını göstermektedir.

Erythrocyte deformability allows the passage of erythrocytes through microcapillaries to carry the oxygen. It has been known that several pathways and second messangers, namely L-arginin-NO pathway, cAMP, cGMP and various protein kinases take roles in erythrocyte deformability. Erythrocytes deformability is known to be decreased in hereditary erythrocyte membrane disorders and hemoglobinopathies such as sickle cell anemia and thalassemia. However, functional significance of Rho/Rho-kinase pathway, which contributes cell shape changes and the reorganization of actin cytoskeleton in both smooth muscle and non-muscle cells, has yet to be explored in erythrocytes. In addition, there is no information about the contribution of this pathway to erythrocyte deformability. In this study, we aimed to investigate the functional significance of Rho/Rho-kinase signal transduction mechanism in human erythrocyte and the contribution of deformability in sickle cell anemia.For this purpose, the expressions of RhoA and Rho-kinase (ROCK-2) proteins in erythrocytes from healthy donors were detected by Western-blotting. Influences of Rho-kinase inhibitors, fasudil and Y-27632 (10-7-10-4 M) on erythrocyte deformability was determined by LORCA ektacytometry in the presence or absence of known Rho activators lysophosphatidic acid (LPA, 10-5 M, 1-15 min) and sphingosine 1-phosphate (S1P, 10-6 M, 5 min) also in basal and mechanical stress induced conditions. The activation of RhoA in LPA and mechanical stress series were evaluated by colorimetric G-LISA activation assay kit. On the other hand, the deformability of sickle cells was tested both in the presence and absence of Y-27632 (10-7-10-4 M). The effect of Y-27632 on erythrocyte sickling rate induced with sodium-metabisulfide was tested by counting the cells by microscopic photography.RhoA and Rho-kinase (ROCK-2) protein expressions were demonstrated by Western-blotting. LPA (10-5 M) reduced the deformability with the concomitant RhoA-GTP reduction. Rho-kinase inhibitors Y-27632 and fasudil also decreased deformability, but had no effects on LPA-induced reduction of deformability. S1P, another member of membrane lipids, did not alter the deformability. Moreover, reduction in erythrocyte deformability and RhoA inactivation were induced by subhemolitic mechanical stress but preincubation with ROCK inhibitors did not change the effect of mechanical stress.Moreover, reduction in erythrocyte deformability and RhoA inactivation were induced by subhemolitic mechanical stress but preincubation with ROCK inhibitors did not change the effect of mechanical stress.Erythrocyte deformability was significantly decreased in sickle cell anemias when compaired with healthy donors. However, Y-27632 had no effect on the deformability of sickle cells. On the other hand, Y-27632 (10-7 M) increased the sickling rate induced by sodium-metabisulfide at 30 minute but had no effect with higher consantrations at various time periods (15, 60, 90 min).Our findings, although indirectly, imply that Rho/Rho-kinase pathway could contribute deformability in human erythrocytes. On the other side, there is no effect of Rho-kinase enzyme inhibition on the deformability and sickling rate of sickle cells.