The Role of lipid peroxidation end product 4-hydroxy-2-nonenal in cell signalling

Abstract

ÖZET Lipid peroksidasyonu son ürünleri hücre içi sinyal iletiminde önemli rol aldıkları için son yıllarda özel bir ilgi odağı olmuşlardır. Bu çalışmada, lipid peroksidasyonu son ürünlerinden biri olan 4-hidroksi nonenal (4-HNE) ve oksidan ajan olarak çok iyi bilinen hidrojen peroksit (H2O2) in oksidatif ve sitotoksik özellikleri karşılaştırmalı olarak 3T3 fibroblast hücre kültüründe araştırıldı. Hücre morfolojisi ve canlılığı ile ilgili bulgular her iki oksidan ajanın hücre yapısında önemli değişikliklere yol açtığını gösterdi. Hücreler 500 uM H2O2 ile 24 s veya daha uzun süre inkübe edildiğinde, apoptotik yapıların oluştuğu ışık mikroskobuyla gözlemlendi. Benzer sonuçlar hücreler 5, 15, 25, ve 35 uM 4-HNE ile inkübe edildiğinde de görüldü. 4-HNE'nin derişimine bağlı olarak hücrelerin kalınlaştığı ve 35 yM 4-HNE ile inkübe edildiklerinde ise tutunma özelliklerini yitirerek solüsyona geçtikleri görüldü. Hücreler 25 ve 50 JM 4- HNE ile 24 saat inkübe edildiklerinde hücre canlılığının sırasıyla % 25 ve % 93 oranında azaldığı tespit edildi. Hücre içinde 4-HNE'nin sebep olduğu reactif oksijen türleri (ROT)'nin oluşumunu tesbit için DCFH-DA floresan boyası kullanıldı. 4-HNE en düşük derişim olarak 5 (JM kullanıldığında dahi hücre içinde florasan ışığın yoğunluğu kontrole göre önemli miktarda arttığı saptandı. Antioksidan özellikleri bilinen ve yapısal olarak birbirinden farklı olan vitamin E (a-tocoferol) ve resveratrol 50 uM derişiminde kullanıldığında ise bu antioksidanla rın 4-HNE'ye bağlı hücre içi ROT oluşumunu önemli ölçüde önledikleri floresan mikroskobu ile gözlemlendi. Bu bulgu 4-HNE'nin hücre içi ROT oluşumuna sebeb olduğunu destekledi. Diferansiyel boyama teknikleri ve DNA analizi sonuçlan 4-HNE'nin 10 (uM ve daha yüksek derişimlerde apoptozize yol açtığını ve bu etkinin vitamin E kullanıldığında önemli ölçüde önlendiğini gösterdi. Hücreler 25 uM 4-HNE 24 s süreyle inkübe edildiğinde, üçlü boyama tekniği ve florasan mikroskop bulgularında apoptotik hücreler parlak turuncu, canlı hücreler ise parlak yeşil görüldü. Elde edilen bulgular, sinyal iletisi mekanizmaları ışığında, 4-HNE nin hücre içinde oluşturduğu ROT ve buna bağlı olarak indüklenen apoptoziz olarak tartışıldı. VII

ABSTRACT Lipid peroxidation end products gained special interest and attention in recent years as mediators and inducers of signal transduction. In the present study, the oxidative and cytotoxic effects of a lipid peroxidation end product, 4-hydoxy nonenal (4-HNE) has been studied and compared with that of a well known oxidant hydrogen peroxide (H2O2) in 3T3 fibroblast cell line. Cell morphology and viability studies showed that both H2O2 and 4-HNE could cause significant cellular deformations and loss of viability. Light microscopy results revealed that incubation of cells with 500 uM H2O2 for 24 hr or longer periods resulted in the formation of apoptotic bodies. Similar results have been observed when cells were incubated with 4-HNE at concentrations as low as 5, 15, 25, and 35 uM. In a concentration dependent manner, cells became thicker and when 35 uM 4-HNE was used detachment and membrane blebbings that are indicating apoptosis have been clearly observed. Treatment of cells for 24 hr with 25 and 50 uM 4-HNE caused 25 % and 93 % loss in cell viability respectively. Intracellular ROS production has been monitored by a florescent probe, DCFH-DA. When cells were treated with 5 uM 4-HNE, a significant increase in florescence intensity has been observed when compared to the control cells. Two structurally different antioxidants; a-tocopherol and resveratrol prevented 4-HNE-induced ROS production to a significant extent when they were used at 50 (uM concentration. This finding provided further evidence for the production of ROS. Differential staining by using fluorescent probes and DNA fragmentation analysis results indicated that 10 uM 4-HNE induced apoptosis and the effect was again overcome by the antioxidants; vitamin E and resveratrol. Furthermore, a combination of acridine orange (AO), Hoechst (HO), and propidium iodide (PI) florescent dyes have been used to differentiate viable, apoptotic and late apoptotic/necrotic cells respectively. Differential staining results indicated that when cells were incubated with 25 pM 4-HNE for 24 hr. apoptotic cells have been observed with condensed orange nucleus whereas viable cells were seen with green nucleus. The results are discussed in the light of cellular signalling mechanisms induced by 4-HNE leading to apoptosis via effecting the overall redox status of the cell. VI