Cloning, characterization and expression of Arabidopsis thaliana G protein alpha subunit gene for structural studies

Abstract

ÖZET PCR ve klonlama teknikleri, GPAİ 'in yapı çalışmalarında kullanılmak üzere birleştirilerek kullanılmıştır. GPAİ, heterotrimer G-proteininin Arabidopsis thaliana' dan elde edilen a-alt birimidir. GPAVm pCIT857 vectörünün içindeki varlığı, restriksiyon enzim analizi ve dizi analizi kullanılarak kontrol edilmiştir. Restriksiyon enzimli ve restriksiyon enzimsiz primerler kullanılarak yapılan polimeraz zincir reaksiyonu sonucu elde edilen GPAİ klonlama ve ekspresyon vektörlerine takılmıştır. Yukarıdaki fikrin analizi için, üç farklı ve paralel düzenek kullanılmıştır. İlk düzenekte, GPAİ, pGEM® -T Easy (Promega), pCR® II- TOPO (Invitrogen), pCR® - XL-TOPO (Invitrogen) alt vektörlerine takılmış, daha sonrada bu vektörlerden çıkartılarak pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia), pGFPuv (Clonetech), pETM-11 ve pETM-30 (EMBL, Heidelberg) ekspresyon vektörlerine takılmıştır. İkinci düzenekte, GPAİ direkt olarak ekspresyon vektörlerine takılmıştır. pGEX- 4T2 vektöründe GST, pGFPuv vektöründe GFP ve pETM vektörlerinde kullanılan His ekspresyon partnerleri yapı çalışmaları için daha iyi protein ekspresyonu elde etmek için kullanılmıştır. Üçüncü düzenekte, GPAİ direkt olarak pCR® T7/NT TOPO (Invitrogen) and pTrcHis® TOPO (Invitrogen) ekspresyon vektörlerine klonlanmıştır. Kullanılan diğer yaklaşımlara kıyasla bu düzenek deneylerdeki basamak ve manüplasyon sayısını minimuma indirmektedir. Bütün klonlama deneylerinde farklı performanslara sahip E. coli- XL 1 Blue, TOP 10 and TOP 10 F' klonlamada ve BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS, BL21-CodonPlus® (DE3)-RIL ekspresyonda kullanılmışlardır.Özet olarak, GPAİ başarıyla pGFPuv'nin 3'MCS bölgesine, pCR® T7/NT TOPO (Invitrogen) ve pTrcHis® TOPO (Invitrogen) vektörlerine klonlanmıştır. GPAVm bu vektörlerdeki varlığı enzim ve dizi analizi yoluyla kontrol edilmiştir. Aynı zamanda rekombinant proteinin ekspresyonu farklı sıcaklık ve IPTG konsantrasyonlarında kontrol edilmiştir. Buna rağmen ekspresyon, SDS-PAGE analiz yöntemiyle gözlemlenememiştir. Bakteri ekspresyon sistemi geliştirilerek yapılacak olan ekpresyon çalışmaları şu anda devam etmektedir.

ABSTRACT A combined PCR-cloning strategy was implemented to express GPA1 for structural studies. To begin with the presence of GPA1, which is the oc-subunit of heterotrimeric G proteins from Arabidopsis thaliana, was checked with restriction enzyme digestion and sequence analysis. PCR was done on the pCIT857 vector including the coding sequence of GPA1. Appropriate primers were designed with and without the restriction enzyme sites to clone the GPA1 into both subcloning and expression vectors. Once the above objective was analysed, three different parallel approaches were used to clone GPA1 from the pCIT857 vector into the expression vectors. In the first approach, GPA1 was subcloned into several vectors including pGEM® -T Easy (Promega), pCR® II- TOPO (Invitrogen), pCR® -XL-TOPO (Invitrogen) vectors. Then GPA1 derived from these vectors were cloned into expression vectors containing pGEX-4T2 (Amersham Pharmacia), pGFPuv (Clonetech), pETM-11 and pETM-30 (EMBL, Heidelberg). In the second approach, GPA1 from the pCIT857 vector was directly cloned into the expression vectors. Different fusion partners of expressed GPA1, GST in pGEX-4T2 and GFPuv in pGFPuv vector and His-taq in pETM vectors, were used to yield the most efficient expression of GPA1, that would form the basis of subsequent structural characterisation experiments. In the third approach, GPA1 from pCIT was directly cloned into the expression vectors including pCR® T7/NT TOPO (Invitrogen) and pTrcHis® TOPO (Invitrogen) vectors. Of the three approaches, this one proved most convenient as the number of steps and manipulations was limited in comparisons to those above.During all subcloning and cloning steps, different strains of E. coli including XLlBlue, TOP10 and TOP10 F' were used as hosts for subcloning and BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, Rosetta(DE3), Rosetta(DE3)pLysS and BL21-CodonPlus® (DE3)- RIL were used for expression. The rationale being that different strains often perform differently. To summarise GPA1 was successfully cloned into 3'MCS of pGFPuv, pCR® T7/NT TOPO (Invitrogen) and pTrcHis® TOPO (Invitrogen) vectors. In particular the verification was based upon the restriction enzyme digestion and sequencing data. Also the recombinant protein was expressed both using different IPTG concentrations and temperatures. But the expression was not detected by SDS-PAGE analysis. Recombinant protein is currently being expressed and further work is in progress to improve the properties of bacterial expression system.