A. thaliana G protein y-subunit gene : Cloning, characterization and expression

Abstract

ÖZET Bu projenin amacı AGG1 geninin klonlanması, karakterizasyonu ve yapı çalışmalı için tek basma veya alfa ve beta altbirimleri ile birlikte ekspresyonudur. A. thaliana G proteini gamma alt birimi proteinini sentezleyen AGG1 geni polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılıp cDNA sekansının verifikasyonu ve analizi amacıyla E coli hücrelerine klonlanmıştır. Verifikasyonu takiben AGG1 geni, rekombinant proteinin yüksek miktarda üretimi için farklı ekspresyon vektörlerine yerleştirilmiştir. Bu vektörler pGEX-4T2, pGFPuv, pTrcHis-TOPO and pT7/NT-TOPO vektörleridir. Farklı E. coli tipleri olan BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS konak hücre olarak kullanılmıştır. AGGl-his işretli proteininin sentezi pTrcHis-TOPO vektörü kullanılarak BL21(DE3)pLysS tipi hücrelerde gösterilmiştir. AGG1 proteini Western transfer yöntemiyle ve Komassi boyama ile poliakrilamid jeller üzerinde gösterilmiştir. Bu çalışma AGG1 geninin ekspresyonunu ve gen ürünü olan proteinin bakteri hücrelerinde sentezini göstermesi açısından ilktir ve AGG1 geninin farklı vektörlere yerleştirilerek karakterizasyonu sağlanmıştır. AGG1 geninin daha verimli ekspresyonunu sağlamak için farklı canlı sistemlerin de denenmesi gerekmektedir.

ABSTRACT The aim of this thesis was to characterize, clone and express AGG1 gene product for structural studies either on its or own together with beta and alpha subunits. The AGG1 gene coding for the Arabidopsis thaliana G protein gamma subunit was amplified by PCR and subcloned in E. coli for verification and analyses of the cDNA sequence. Following source sequence verification AGG1 was inserted into different expression vector for overexpression of the recombinant protein. These vectors included pGEX-4T2, pGFPuv, pTrcHis-TOPO and pT7/NT-TOPO. Different E. coli strains including BL21(DE3) and BL21(DE3)pLysS, were tried as host cells. Expression of AGGl-his tag fusion protein using pTrcHis-TOPO in BL21(DE3)pLysS cells was demonstrated. AGG1 protein was detected by Western blotting and coomassie blue staining of polyacrylamide gels. This study is the first report of AGG1 expression and synthesis of the gene product in a bacterial cell and it provides characterization of different AGG1 gene containing constructs. Further work is needed for more efficient expression of AGG1 in other host systems.