Construction of a GFP containing recombinant plasmid facilitating immobilization, visualization and quantification of fusion proteins on interactive polymeric surfaces

Abstract

ÖZET Uygun biçimde değişikliğe uğratılmış yüzeyler üzerine enzimler veya sinyal peptitleri gibi her türlü proteini sabitlemek amacıyla iki bileşenli bir sistem tasarlandı ve oluşturuldu. Sistem, çoklu (6'lı) histidine dizisi kodlayan bir kısım, GFP (yeşil parlayan protein) geni, sabitlennıesi hedeflenen proteinin geninin yerleştirilebileceği bir çoklu klonlama bölgesi içeren yüzey sabitlemeye özelleşmiş bir plazmid ve eksi yüke sahip işlevsel gruplar taşımak üzere değişikliğe uğratılmış, etkileşen bir yüzeyden oluşmaktadır. Çoklu (6) histidine kodlayan kısım içeren hedeflenen plazmid gen klonlama ve ekspresyonu için optimize edilmiş olan pETM-1 1 ekspresyon vektörü değiştirilerek elde edilmiştir. pETM-ll'in optimize edilmiş özelliklerini daha iyi korumak için, uygulamamızda gerekli olmayan MAD geni çıkarılmış, yerine sırasıyla çerçeve kayması engelleyici bir adaptör ve pGFPuv vektöründen elde edilen, MAD geniyle yaklaşık aynı uzunlukta olan GFP geni yerleştirilmiştir. Sözü edilen `çerçeve kayması engelleyici adaptör` -kodon çerçevesini doğru diziye ayarlayan, histidin tutunucu dizisi ile parlayan GFP bağlayıcısını birleştiren küçük nükleotid dizisi- MAD geninin GFP geniyle değiştirilmesi sonucu oluşacak olan çerçeve kayması mutasyonunu engellemiştir, lik olarak bu adaptör, fiziksel olarak çok esnek bir amino asit dizisini (Gly-Gly-Thr) kodlamak ve böylece GFP'nin solüsyon fazı karakteristiğini mümkün olduğunca korumak üzere tasarlanmıştır. Sonuçta elde edilen, GFPİmm olarak adlandırılan `sabitleme adaptörü` protein konstrakt, ekspresyondan sonra hem Ni21 çoklu histidin ilgi kolonu hem de iyon değiştirme kromatografısi kullanılarak izole edildi. İzolasyon sonrasında proteinin yüzeye bağlanma özellikleri, değiştirilmiş yüzeye sahip 96-kuyulu polistiren kaplar kullanılarak denendi. Bu çalışmada, çoklu histidine gruplarım yüzeye bağlamak için genelde kullanılan Ni2' ile imidazol arasındaki koordinasyon bağının yerine histidinin artı yükleri ile yüzeydeki eksi yükler arasında tuz bağı oluşturma stratejisi uygulandı. Buna paralel olarak polistiren yüzey de persülfat kullanılarak eksi yüklü yüzey grupları taşımak üzere değişikliğe uğratıldı. Bu çalışmada tasarlanan ve oluşturulan rekombinant vektörün sadece gen klonlama ve ekspresyonda değil, aynı zamanda kolay protein izolasyonu, hedef proteinlerin birleştirme yöntemi kullanılarak görsel işaretlemesi ve biyoteknoloji endüstrisinde kullanılabilecek özelleşmiş yüzey sabitleme uygulamalarında da işlevsel olacağı düşünülmektedir. ix

ABSTRACT A two-component system was designed and developed to facilitate immobilization of any peptide such as enzyme or signal peptide onto appropriately modified surfaces. The system was based upon a specialty plasmid that codes a sequence for a poly(6)histidine tag, a GFP (green fluorescent protein) gene, and a multiple cloning site, to which the gene of the target peptide may be inserted, and an interactive surface that was tailored with negatively charged functional groups. The target plasmid bearing a poly(6)histidine coding region was engineered starting from pETM-l 1 plasmid, which is a vector optimized for expression purposes. In order to better preserve the traits of pETM-l 1, the non-essential gene of a protein called MAD was excised and replaced with a frame adaptor, as well as GFP gene of comparable size to MAD. This `frame adaptor` -a frame-adjusting, small oligonucleotide sequence joining the histidine anchors and the fluorescent GFP linker- prevented the frameshift problem that would be introduced after substituting the MAD gene with the GFP gene. In addition, it was designed to code for a highly flexible sequence of amino acids (Gly-Gly-Thr) to best preserve the solution-phase traits of the GFP gene. The finalized `immobilization adapter` protein construct, termed GFPimm, was expressed and isolated using either a Ni2' polyhistidinc tag affinity column or ion exchange chromatography. Following isolation, the protein is tested for binding performance using surface-modified polystyrene 96-well plates. In contrast to the typical mode used to bind polyhislidine tags, in which a coordination bond between Ni2+ and imidazole anchors the protein to a surface, the strategy proposed herein was to exploit the positive charges of histidine and negative charges on the surface to achieve salt bridging. For this purpose, a polystyrene surface was modified to bear negatively charged surface groups via incubation with a persulfate reagent, ammonium persulfate. It follows that the recombinant vector designed and constructed in this study is not only amenable to cloning and expression but also for realizing easy purifications, visual tagging of target proteins by fusion methodologies, and performing immobilizations in specialty applications.