Influence of calcium deficiency on superoxide generating NADPH oxidase and antioxidant defense systems in bean root cells

Abstract

ÖZET Kalsiyum (Ca) bitkilerin büyüme ve gelişmesi için mutlak gerekli bir besin elementidir. Örneğin hücre genişlemesi, hücre duvarının güçlenmesi, sinyal iletimi ve membran taşınımı gibi birçok fizyolojik süreç bitkilerin Ca beslenmesinden çok etkilenmektedir. Memeli sistemlerinde yapılan çalışmalara göre, superoksit radikal üreten NADPH oksidaz aktivitesi ve antioksidatif savunma sistemleri üzerinde Ca'un önemli etkilisi bulunmaktadır. Bitkideki Ca'un NADPH oksidaz ve antioksidatif savunma sistemleri üzerindeki etkisi çok az çalışılmıştır. Bu yüksek lisans çalışmasında Ca'un superoksit üreten NADPH oksidaz ve antioksidatif savunma sistemleri (superoksit dismutaz, askorbat peroksidaz, glutation redüktaz, katalaz, askorbik asit ve SH-grupları) üzerindeki rolü değişik oranlarda Ca içeren (50 uM'dan 2000uM'a) besin çözeltilerinde yetişen fasulye bitkisinin (Phaseolus vulgaris, ev Nassua) kök hücrelerinin sitozolik fraksiyonu kullanılarak çalışılmıştır. Elde edilen bulgular, yeterli miktarda Ca (2000 u.M) ile beslenen bitkilere farklı oranda düşük Ca dozları (50 uM'dan 2000uM'a) uygulandığında kuru madde üretiminin ve köklerin uzamasının azaldığım ve köklerin kahverengileştiğini göstermiştir. Kalsiyum eksMiğinin neden olduğu kök büyümesindeki azalmanın yeşil aksam büyümesindeki azalmaya oranla daha şiddetli olduğu bulunmuştur. Yeterli Ca ile beslenen bitkilerle karşılaştırıldığında NADPH oksidaz aktivitesi ve NADPH' a bağımlı Of` üretimi Ca noksanlığmdaki bitkilere ölçütle azalmıştır. Bu azalma en düşük Ca uygulamasında daha belirgin olmuştur. Kalsiyum eksikliğindeki köklere 8, 24 ve 48 saat süreyle Ca uygulaması NADPH oksidaz aktivitesini ve NADPH'a bağımlı O2` seviyesini tekrar arttırdığım göstermiştir. NADPH oksidazın inhibitörü, dipenil iyodiniyum (DPI), NADPH'a bağımlı Of` üretirninin % 50 oranında azalmasını sağlamıştır. Antioksidatif savunma sistemlerinin analizlerinde Ca eksikliği askorbikasit konsantrasyonunu etkilemezken, SH-gruplarının (temel glutation) konsantrasyonunu ise belirgin bir biçimde azaltmıştır. Antioksidatif enzimlerden, süperoksit dismutaz, askorbat peroksidaz ve katalaz aktivitesi köklerde Ca eksikliği stresinden etkilenmemiştir. Ancak, glutation redüktaz aktivitesinin Ca eksikliğinden dolayı büyük oranda azalması, köklerdeki glutationun redox durumu üzerinde Ca'un etkisinin olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, kök hücrelerinde NADPH oksidaz aktivasyonuyla oluşan O2` üretimi için Ca'un gerekli olduğunu işaret etmektedir. NADPH' a bağımlı Of` üretimi bitkilerin değişik biyotik ve abiyotik stres faktörlerine karşı adaptasyonunda rol almasından dolayı Ca'un NADPH oksidaz üzerindeki bu olumlu etkisi, onun bitkilerin çevresel etmenlere karşı adaptasyonda ne denli önemli olduğunu göstermektedir. Anahtar Kelimeler: kalsiyum eksikliği, Phaseolus vulgaris, kök, NADPH oksidaz, süperoksit radikali, antioksidatif savunma sistemi

ABSTRACT Calcium (Ca) is an essential mineral nutrient element involved in growth and development processes of plants. There are several physiological processes, which are greatly affected by Ca nutritional status of plants such as cell extension, cell wall stabilization, signal transduction and membrane transport. Based on the studies in mammalian systems Ca was found to be effective on activity of superoxide radical (O2`) generating NADPH oxidases and antioxidative defense systems. The effects of Ca nutritional status of plants on NADPH oxidase and antioxidative defense systems in plant cells are rarely studied. In the present MSc study, the role of Ca on Of` generating NADPH oxidase and antioxidative defense systems (i.e., superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, glutathione reductase, catalase, ascorbic acid and non-protein sulfhydryl-compounds) was studied in cytosolic fractions of root cells by using bean (Phaseolus vulgaris, cv. Nassua) plants grown in nutrient solution with different Ca supplies (50 uM to 2000 uM). The results obtained show that exposure of Ca-adequate plants (2000 uM Ca supply) to different levels of deficient Ca supply (50 uM to 250 uM Ca) reduced the dry matter production and elongation of roots and caused brownish color formation along the roots. The decrease in root growth caused by Ca deficiency was more severe than the decrease in shoot growth. Compared to Ca-sufficient plants, the levels of NADPH oxidase and NADPH-dependent O2 ` generation were distinctly decreased in Ca- deficient plants. This decrease was more pronounced at the lowest Ca supply (50 uM). Resupply of Ca to Ca-deficient roots for 8, 24 and 48 h markedly enhanced the activity of NADPH oxidase and the NADPH-dependent O2` generation. Pretreatment with the inhibitor of NADPH oxidase, diphenylene iodonium (DPI), inhibited the rate of NADPH-dependent O2 ` generation by around 50 %. Analysis of antioxidant defensesystems showed that Ca deficiency did not effect the ascorbic acid concentration, but markedly reduced the concentration of non-protein sulfhydryl (SH)-compounds (predominantly glutathione). Of the antioxidant enzymes, the superoxide dismutase, ascorbate peroxidase and catalase were not affected by Ca deficiency stress in roots. However, the activity of glutathione reductase was severely diminished by Ca deficiency, indicating a particular affect of Ca on redox status of glutathione in roots. The results indicate that Ca is required for generation of O2 ` by activating NADPH oxidase in root cells. As NADPH-dependent O2` generation is involved in adaptive response of plants to different biotic and abiotic stress factors, maintenance of high activity of NADPH oxidase by adequate Ca supply was considered as a fundamental role of Ca in growth and development processes of plants. Keywords: calcium deficiency, Phaseolus vulgaris, root, NADPH oxidase, superoxide radical, antioxidant defense system