Cloning, characterization and expression of a novel metallothionein gene (mt-d) from Triticum durum

Abstract

ÖZETmt-d ve mt-a olarak isimlendirilen iki farklı metallothionein geni buğday(T.aestivum ve T.durum) genomik DNAsında belirlenerek karakterize edilmiştir.Karşılaştırmalı olarak bakıldığında mt-d ve mt-a genlerinin 416 ve 399 nükleotide sahipolduğu belirlenmiştir. İki genin nükleik asit düzeyinde birbirleriyle %95 benzerliğesahip oldukları gösterilmiştir. Dizi analizi sonuçunda bu farkın T.durum' un intronbölgesinde bulunan 2 ekstra TTTTTA tekrarından kaynaklandığını belirlenmiştir.mt-genlerini kodlayan cDNA'ler RT-PCR yöntemi kullanılarak belirlenmiştir.Gen dizi algorithmaları hem mt-a hem de mt-d cDNA'larının açık okuma bölgelerinin75 amino asiti amino ve karboksi- uçlarının Cys-X-Cys motifine sahip olacak şekildekodladıklarını göstermektedir. mt-d ve mt-a genlerinden elde edilen amino acid dizileriSınıf II Tip 1 grubunda yer alan diğer MT proteinleri ile dikkat çekici bir benzerlikgöstermektedir. Ayrıca bu iki gen protein düzeyinde birbirlerine 100% benzerlikgöstermektedirler. Bu sonuçlarında belirttiği gibi T.durum'dan elde edilen mt-d geni?yeni bir tip 1? MTdir.Durum MT protein (dMT)'in ekspresyonu, lokalizasyonu ve diğer proteinler ileolan etkileşmlerin araştırılması için yapılacak ileriki çalışmalar için mt-d geni pGFPuvvectörünün 5' coklu klonlama bölgesine eklenmiştir. Klonlamanın doğrulanması enzimkesim analizleri ve dizi analizi sonuçlarına bakılarak yapılmıştır. Ancak, ne doğrudanGFP ekspresyonu ile ne de SDS-PAGE analizi ile mt-d genin ekpresyonugözlenememiştir. Detaylı bir dizi analizi bu probleme GFPuv kodlama dizisi üzerindeoluşan bir nokta mutasyonunun sebep olduğunu göstermiştir. Nokta mutasyonu erkenbir sonlanma kodonu oluşmasına, bu da füzyon proteininin erken sonlanmasına sebepolmuştur.Burada sunulan sonuçlar ile T.durum da metallothionein genin varlığıgösterilmiştir.GFP kullanarak meydana getirilen füzyon proteinin ekspresyonçalışmalarında başarısız olunsa da bu amaçın takip edilmesi ve ekspresiyonda başarısağlanması metallothioneinin bitki sistemlerindeki gerçek rolüne ışık tutması açısındançok önemlidir..

ABSTRACTTwo different metallothionein genes, labelled as mt-d and mt-a were identified inwheat (Triticum durum and Triticum aestivum) genomic DNA sequences werecharacterized. mt-d and mt-a, were found to contain 416 and 399 nucleotides,respectively. Nucleic acid sequence alignment showed 95 % similarity between thetwo. Sequencing results showed that the difference resulted from two extra TTTTTArepeats in the intron regions.cDNAs encoding mt-genes were identifed by RT-PCR. Gene alignmentalgorithms strongly suggested that both of these cDNAs (mt-a and mt-d) encoded anopen reading frame of 75 amino acids with two cysteine-rich domains featuring Cys-X-Cys motifs at the amino- and carboxy termininus. The deduced amino acid sequences ofmt-a and mt-d genes show striking similarity to the MT-like proteins described withinthe Class II as Type 1 MTs and showed 100 % similarity with each other as deducedfrom cDNA sequencing results. These results indicate that mt-d from T.durum forms a?novel type 1? MT.For further studies of mt-d expression, localization of the durum metallothioneinprotein (dMT) and its interactions with other proteins mt-d gene was inserted into the 5?MCS of pGFPuv vector. Verification was based on sequence data and restrictionenzyme analysis. However, expression could not be validated by neither by visualdetection of GFP expression nor by SDS-PAGE analysis. A more detailed sequenceanalysis indicated that the problem was due to a point mutation within the codingsequence of the GFPuv, resulting in a stop codon and premature termination of thefusion protein.Results presented here show the presence of metallothionein gene in the wheatTriticum durum. Although our attempts to express the gene as a fusion protein togetherwith GFP to facilitate its localization in different systems was not successful it will beimportant in future studies to pursue this goal and achieve expression of labelled proteinin plant systems to gain insights into its exact function in plants.