Molecular mechanism of aven in taxane induced apoptosis in er (+/-) breat cancer cell lines; MCF-7 and MDA-MB-231 cells

Abstract

Bu çalışmada, MCF-7 ile MDA-MB-231 hücrelerinde taxane tarafından indüklenen apoptotik sinyal ileti yolaklarına Aven proteinin etkisi çalışılmıştır. Taxane grubu ilaçlar, hücre için toksiktirler ve etkilerini mikrotübüller üzerinde göstererek, mitoz için gerekli olan mikrotübül ağının deformasyonuna neden olurlar.İlk olarak, hücrelere 24 saat ilaç verilerek, sitotoksik etki MTT ile ölçülmüştür. MCF-7 hücrelerine 50 nM paclitaxel verildiğinde hücre çoğalması yüzde 58'e düşerken, MDA-MB-231 hücrelerinde bu düşüş yüzde 44 olmaktadır. Aynı şekilde, 50 nM docetaxel verildiğinde hücre çoğalması MCF-7 lerde yüzde 55'e, MDA-MB-231 de ise yüzde 70'e düşmektedir. Optimum ilaç dozunun belirlenmesinden sonra, ilaç verildiğinde Aven proteinin değerindeki değişim immunoblotlama yöntemiyle çalışılmıştır. Sonuçlara göre ilaçlar Aven proteinin seviyesinde bir değişime yol açmamaktadır. Bir sonraki aşamada, taxane grubu ilaçların protein-protein ilişkilerinde herhangi bir değişime neden olup olmadığı ikili immunoçökeltme ile araştırılmıştır. Endojen Bcl-xL proteini immunoçökeltme yöntemiyle çökertilmiş, sonra da Aven antikoru ile immunoblotlanmıştır. İlaçların Aven ile Bcl-xL proteinleri arasındaki interaksiyonu bozmadığı görülmüştür. Bu çalışmada Bcl-xL proteinin fosforile olduğu immunoblotlama yöntemiyle gösterilmiştir. Hücreler pSG-HA-Aven plasmidi ile transfekte edilerek Aven proteinin hücre içerisinde daha fazla üretilmesi sağlanmış ve bunu göstermek için immunoblotlama yöntemi kullanılmıştır. Her iki hücrede de Aven seviyesi Hs_Aven_3_HP siRNA ile azaltılmıştır. Genin susturulması hem RNA hem de protein seviyesinde gösterilmiştir. Bir basamaklı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu ve gerçek zamanlı ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak mRNA seviyesi kontrol edilmiştir. MCF-7 hücrelerinde Aven seviyesinde 2.3 katlık bir azalma olurken, MDA-MB-231 hücrelerinde bu azalış 1.7 kat olmaktadır. Daha sonra hücrelerdeki apoptoz M30 Apoptoza duyarlı ELISA kitiyle ölçülmüştür. Endojen Aven seviyesindeki artmanın daha az apoptoza yol açtığı görülmüştür. MDA-MB-231 hücrelerinde ise Aven seviyesindeki artma taxane grubu ilaçlara karşı hücreleri hassas hale getirmiştir. Hücre içi Aven seviyesi düşürüldüğünde ise, apoptoza gidiş azalmıştır.

In this study, the molecular mechanism of Aven in taxane induced apoptosis were studied in ER(+) MCF-7 and ER(-) MDA-MB-231 cell lines. Taxanes, paclitaxel and docetaxel, are cytotoxic agents which act by promoting deformation of stable microtubules, inhibiting the normal dynamic reorganization of microtubule networks required for mitosis.First the dose kinetics of apoptotic response towards the above mentioned drugs with these two cell lines were established. Cytotoxicity was determined with MTT assay after cells were treated with the drugs for 24 hours. 50nM Paclitaxel treatment for 24h inhibited growth of MCF-7 by 58 percent and MDA-MB-231 by 44 percent. Whereas 50nM Docetaxel caused growth inhibiton by 55 percent and 70 percent for 24h in MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines respectively. Then Aven protein levels in response to these drugs were studied by western blot analysis. The western blot results showed that Aven protein levels were not changing in response to taxanes in these cell lines. After that the effect of the drugs on protein-protein interaction was investigated with CoIP experiments. Endogeneous Bcl-xL protein was immunoprecipitated with specific Bcl-xL antibody and then immunoblotting was done with anti-Aven antibody. The interaction of Aven with Bcl-xL was not abolished with taxane treatment. The phosphorylation of Bcl-xL with taxane treatment was also shown by western blot analaysis. The overexpression of Aven by transfection of both cell lines with pSG-HA-Aven plasmid was performed and then Aven overexpression was checked by western blot analysis. As a control, immunoprecipitation of total protein extract with anti-HA antibody was made. But results showed non-specific binding of endogeneous Aven to HA antibody. As a second strategy, gene silencing was used. Aven expression was downregulated by Hs_Aven_3HP siRNA and protein level. The mRNA level of Aven was determined first with one step RT PCR and then with quantitative real time RT PCR. The downregulation of Aven was 2.3 fold in MCF-7 cells and 1.7 fold MDA-MB-231 cells. After that, taxane induced apoptotic cell death was investigated by M30 Apoptosense ELISA Kit. The overexpression study showed that taxane induced apoptosis in MCF-7 cells increased by 2 fold. Whereas downregulation of Aven protects MCF-7 cells from apoptosis induced by taxanes. For cisplatin, Aven overexpression resulted in less apoptotic cell death in MCF-7 cells. In MDA-MB-231cells, overexpression of Aven sensitizes cells for apoptotic cell death. When Aven was downregulated, drugs induced less apoptotic cell death.