Biophysical and functional characterization of wheat metallothionein at molecular level

Abstract

Metallotioninler (MT'ler), sistin bakımından zengin, düsük molekül ağırlıklı Zn,Cu ve Cd gibi metallere yüksek bağlanma kapasitesi olan proteinlerdir. MT'ler hemenhemen tüm organizmalarda bulunurlar ve gen sekanslarındaki sistin motiflerinindağılımına göre bir familya içerisinde sınıflandırılırlar. Bitki Tip 1 MT'leri, düsükmolekül ağırlıklı (7-8 kDa), aromatik grupları olmayan metal bağlayan proteinlerdir.Yaklasık 30-45 amino asitten olusan oldukça uzun evrimsel korunmus bir köprü bölgesiile birlestirilmis iki metal bağlama bölgesine sahiptiler. Son zamanlardaki çalısmalargöstermistir ki bu familyanın tüm üyeleri bir tip islevde rol oynamaz. Aksine bazıMT'ler metal dengesini korumada islev görürken diğerleri ağır metallerindetoksifikasyonunda rol oynarlar. MT sekansları ve fonksiyonel rolleri hakkında çokgenis literatür olmasına rağmen, saflastırılmıs proteinler üzerine doğrudan biyokimyasalve biyofiziksel verilerin olamaması farklı kaynaklardan gelen MT'lerin sekans, yapı,metal bağlama ve fonksiyon iliskilerinin kapsamlı bir sekilde ortaya çıkarılmasınıengellemektedir.Oligomer olusturma eğilimleri, oksitlenme hassasiyetleri, özellikle köprübölgesinden kırılmaları ve derisim belirlemedeki zorluklar nedeniyle bitki MT'lerininsaflastırılmasında standart yöntemler doğrudan uygulanamazlar. Triticum durum'dan birTip 1 MT'ni, dMT, E. coli bakterisinde GST ile füzyon proteini seklindesentezlettirilmistir (Bilecen 2005). Bu doktora tezi çalısmasında GSTdMT füzyonproteini bir model sistem olarak kullanılarak dMT'nin yapı ve fonksiyon iliskisiarastırılmıstır. GSTdMT saflastırılması için anaerobik ortamda Cd konsantrasyonu, özelindirgeyici ajanlar ve tampon seçimi gibi kiritik parametreler optimize edilerek yeni birsüreç gelistirilmistir.Saflastırılan GSTdMT büyüklük ayırmalı kromofotografi (SEC), SDS ve nativPAGE, UV-vis absorpsiyon spektrofotometresi, ICP-OES emisyon spektrofotometresi,dinamik ısık saçılması (DLS), sirküler dikroizm (CD), EXAFS ve X-ısınları küçük açısaçılma (SAXS) yöntemleri kullanılarak karakterize edilmistir.SEC ile dengeli dimer formunda GSTdMT proteini ayrıstırılmıstır. SaflastırılanGSTdMT solüsyonları tek tip yapı içermeleri ve homojen olmaları açısından yapısal vefonksiyonel calısmalar için uygundurlar. GSTdMT'nin Cd bağlayabilme özelliği UV-visabsorpsiyon spektrofotometresi ile belirlenmis ve ICP-OES ölçümleri yoluyla Cd2+bağlanma oranı 3.5 Cd2+/protein olarak bulunmustur. Bu bulgu aynı zamanda Cd-Skoordinasyonunun dört süllfür ile gerçeklestiğini gösteren EXAFS ölçümü iledoğrulanmıstır.SAXS ölçümleri GSTdMT nin eylemsizlik yarıçapı 3.57 nm olan uzun veasimetrik bir sekle sahip olduğunu göstermistir. ab initio modelleri bir uçta iki dimerGST molekülünün olusturduğu bir elektron yoğun bölge ve bu bölgeden uzanan ikidMT molekülünden olusan bir yapı ile sonuçlanmıstır. dMT yapısının GSTdMTfüzyonundaki GST den bağımsız olduğu ortaya çıkmıstır. SAXS sonuçlarınınbiyokimyasal verilerle birlesimi dMT yapısı için saç firketesi benzeri bir modelinvarlığını ortaya çıkarmıstır.Sonuçlar füzyon protein içerisinde dMT metal içeriğinin ve yapısınınkorunduğunu göstermistir. Bundan dolayı GSTdMT biyolojik olarak anlamlı yapısalparametrelerin belirlenmesinde kullanılabilinir.Bir önceki çalısmada (Bilecen 2005) köprü bölgesi için tahmin edilen yapınınDNA'ya bağlanan proteinleri içeren bir familya ile benzerlik gösterdiği bulundu. Butezde dMT'nin DNA bağlanma ihtimali ?Whole genome PCR? yöntemi ilearastırılmıstır. Bu yöntemin uygulamasında birçok sorunun olusabileceği bulunmusturve her hangi bir proteinin DNA bağlanma ihtimalinin arastırılmasındakullanılamayacağı bulunmustur.Bu çalısmanın diğer kısmında of Triticum durum cvs. Balcalı-85 bitkisininçevresel Cd'a olan tepkisi arastırılmıstır. Balcalı-85 artan Cd konsantrasyonlarına tabiitutulmustur (0, 2, 5, 10, and 20 ?M Cd). Sonuç olarak kök ve yesil aksanda kuruağırlığın azalması gözlemlenilmistir. Ayrıca Balcalı-85'in köklerinde çok fazla Cdtutma kapasitesinde olduğu bulunmustur. Bu çalısma mt-d geni ve Cd tepkisi arasındakibağlantıyı bulma arastırmasının bir parçası olarak yapılmıstır.Ayrıca, southern blot analizi ile 2 ekson ve 1 kodlamayan introndan olusan mt-dgeninin T. durum genomunda sadece bir kopya olarak bulunduğu gösterilmistir.

Metallothioneins (MTs) are small, cysteine-rich proteins with high bindingcapacity for metals including Zn, Cu and Cd. MTs exist in a wide range of organismsand are classified in one super-family according to the distribution of cysteine motifs intheir sequences. Plant Type 1 MTs are low molecular weight (7-8 kDa) aromatic residuelacking metal-binding proteins. They have two metal-binding domains separated by aconserved specifically long spacer region of about 30-45 amino acids. Recent studiesindicate that all members of this family do not have a single unifying function; whilesome MTs participate in metal homeostasis others play a role in detoxification of heavymetals. Despite the large literature on MT sequences and functional roles, lack of directbiochemical and biophysical data on purified proteins hinders a comprehensiveunderstanding of sequence, structure, metal-binding and function relationships in MTsfrom different sources.Due to their aggregation propensity, sensitivity to oxidation, proteolytic cleavageespecially in the spacer region and difficulties in quantification, standard methods couldnot be directly used for purification of plant MTs. A Type 1 MT from Triticum durum,dMT, was expressed in E. coli cells as a fusion protein with GST (Bilecen et al., 2005).In the present study structure-function relationship of dMT is investigated using thefusion protein GSTdMT as a model system. The procedure developed for GSTdMTpurification required strict anaerobic conditions and critical parameters includingconcentration of Cd and specific reducing agents, as well as choice of buffers wasoptimized.The purified GSTdMT was characterized by size exclusion chromatography,SDS- and native-PAGE, UV-vis absorption spectrophotometry, inductively coupledplasma optical emission spectroscopy (ICP-OES), dynamic light scattering (DLS),circular dichroism (CD), Extended X-ray Absorption Fine Structure (EXAFS) andsmall-angle solution X-ray scattering (SAXS).Size exclusion chromatography revealed a stable dimeric form of GSTdMT insolution. Purified GSTdMT solutions were monodisperse and homogeneous and thussuitable for structural and functional studies. The Cd binding ability of GSTdMT wasinitially characterized by UV-vis absorption spectroscopy and through the ICP-OESmeasurements the Cd2+ binding ratio was found to 3.5 Cd2+/protein. This finding wasfurther confirmed by EXAFS measurement which strongly indicated Cd-S coordinationwith four sulphurs.SAXS measurements revealed that GSTdMT has an elongated shape with aradius of gyration of 3.57 nm. ab initio models resulted in a structure in which twoGST molecules form an electron dense region at one end of the dimer and the two dMTmolecules extend from this region. dMT structure appears to be independent of GST inthe GSTdMT fusion. The combination of SAXS results with biochemical data lead tothe proposal of a hairpin like model for dMT structure.Results show that the metal content and structure of dMT in the fusion proteinare preserved, thus biologically relevant structural parameters can be determined usingthe GSTdMT construct.In a previous study (Bilecen et al., 2005) the predicted structure for the spacerregion had shown similarity with that of a family that includes DNA binding proteins.In this thesis DNA binding possibility of dMT protein was examined through the wholegenome PCR-based screening method. It was found that application of this methodresulted in several artifacts and in our hands the method could not be used forinvestigation of DNA binding possibility of any protein.In part of this work response of Triticum durum cv. Balcalı-85 to environmentalCd was investigated. Balcalı-85 was subjected to increasing Cd concentrations (e.g., 0,2, 5, 10, and 20 ?M Cd). As a result, reduction in dry weight matter was observed bothin roots and shoot. Also, it was found that Balcalı-85 has high capacity to retain Cd inroots. These studies were carried out as a part of an investigation which will focus onthe correlation between mt-d gene expression and Cd response.In addition, southern blot analysis revealed that the mt-d gene, having 2 exonsand a non-coding intron region, has a single copy in T. durum genome.