Role of Bcl-2 family members in 4-HNE induced apoptosis

Abstract

Bu çalışmada, 4-HNE ile indüklenen apoptozda Bcl-2 protein ailesi üyelerinin rolü, ateroskleroza model teşkil eden endotel ve monosit hücreleri kullanılarak araştırılmıştır.Hücre canlılığı ve Annexin-V boyama deneyleri, 4-HNE uygulamasının hem insan göbek bağı damar içi endotel hücrelerinde (huv-e-c-c) hem de insan lösemi monosit lenfoma hücre hattında (U937 hücreleri) sitotoksik olduğunu ve doza bağlı olarak apoptozu teşvik ettiğini göstermiştir. Apoptoz mekanizması hakkında daha ayrıntılı bilgi sahibi olmak amacıyla, Bcl-2 protein ailesi bireylerinin protein miktarları immunoblot analizleri ile incelenmiştir.20 ?M 4-HNE ile muamele edilen huv-ec-c'lerde, Bcl-XL ve Bax proteinlerinin seviyesi 4 saat içinde yükselmesinin ardından Bcl-2 proteinin seviyesinde ani bir azalma gerçekleşmiştir. Apoptoza indükleyen Bcl-2 protein ailesi üyelerinden, Bid'in kesilmesi de Bcl-2 proteinin azalmasından önce gözlenmiştir.12 saat boyunca 20 ?M 4-HNE ile muamele edilen U937 hücre hattında, Bcl-XL proteinin miktarı 2 saatte azalıp, bunu mütakiben 4. saatte kontrol miktarına geri dönerken, Bcl-2 protein miktarı zaman içerisinde belirgin bir azalma göstermeye devam etmiştir. Bcl-2 ve Bcl-XL' den farklı olarak Mcl-1 protein seviyesinde 12 saat süren muamele esnasında herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. Apoptoza indükleyen Bcl-2 protein ailesi üyelerinden Bax seviyesi artarken, mitokondri zarındaki por oluşumunda sorumlu diğer önemli protein olan Bak'ın protein seviyesinde 4-HNE ile muamelesinden 2 saat sonrasından başlayan bir azalma gerçekleşmiştir.24 saat boyunca 10 ?M 4-HNE ile muamele edilen U937 hücre hattında ise Bcl-XL protein miktarı 2 ve 8 saat arasında azalırken Bcl-2 protein miktarı 2 ve 12 saat aralığında azalmıştır. Bcl-XL ve Bcl-2 proteinlerinin miktarlarının hücre içinde yeniden temini sırasıyla 12 ve 24. saatlerde gerçekleşmiştir. Mcl-1 ve Bak protein miktarlarında değişme gözlenmemiştir. Bir önceki yüksek doz sonucuna benzer olarak Bax protein seviyesindeki artış burada da görülmüştür. Bim ve Bid proteinlerinin seviyeleri de immunoblot yöntemiyle çalışılmış ancak herhangi bir değişim bulunmamıştır.Deneysel sistemizde, farklı hücreler (huv-ec-c ve U937 hücre hatları) ve farklı Bcl-2 protein ailesi bireylerinin (yaşam destekleyici proteinlerden; Bcl-2, Bcl-XL ve Mcl-1; apoptoz destekleyici proteinlerden Bax, Bak, Bid ve Bim) seviyeleri 4-HNE muamelesi sonucu tetkik edilmiştir. Kısaca Bcl-2 proteinleri temel olarak hücreye spesifik cevap vermiştir. Bu proteinlerden huv-ec-c'lerde Bcl-XL ve Bax artarken Bcl-2 azalmıştır. U937 hücre hattında ise Bcl-XL ve Bcl-2 erken saatlerde azalırken, Mcl-1 seviyesi aynı kalmış ve Bax seviyesi artmıştır. Sadece Bak proteini monosit hücrelerinde farklı 4-HNE dozlarına farklı cevap vermiştir ve Bak proteininin apoptoz mekanizmasındaki rolünü aydınlatmak için daha ayrıntılı çalışmalar gerekmektedir.Bu sonuçlar, düşük ve yüksek doz 4-HNE ile teşvik edilen apoptozda ve 2 farklı hücre hattında, mitokondrial yolağın katılımını ve Bcl-2 ailesi proteinlerinin sırasıyla aktivasyonunu göstermiştir.

In this study we have investigated the role of Bcl-2 protein family members in response to 4-HNE induced apoptosis by using endothelial cells and monocytes as models for atherosclerosis.Cell viability and Annexin-V staining experiments demonstrated that 4-HNE was cytotoxic for both human umbilical vein endothelial cells (huv-ec-c`s) and human leukemic monocyte lymphoma cell line (U937 cells) and induced apoptosis in a dose dependent manner. In order to gain further insight into the apoptotic mechanism, the protein levels of Bcl-2 family members were investigated by immunoblot analysis.In 20 ?M 4-HNE treated huv-ec-c`s, Bcl-XL and Bax were upregulated within 4 hours of treatment, followed by a sharp decrease in the prosurvival Bcl-2 protein. Among proapoptotic members of the Bcl-2 family; Bid truncation occurred prior to Bcl-2 down-regulation.In 20?M of 4-HNE treated U937 cell line for 12 hours, Bcl-XL was downregulated at an early time point of 2 hours, then restored back to control level at the 4th hour, whereas prosurvival Bcl-2 had a sharp decrease in a time dependent manner. Contrary to Bcl-2 and Bcl-XL, the protein level of Mcl-1 did not change in 12 hours time after 4-HNE treatment. The proapoptotic member of Bcl-2 family, Bax was upregulated however Bak, responsible for pore formation on the mitochondria membrane, was downregulated after the 4-HNE treatment in 2 hours time.In 10?M of 4-HNE treated U937 cell line for 24 hours, Bcl-XL down-regulation took place between 2 to 8 hours and Bcl-2 was downregulated at 2 to 12 hours then Bcl-XL and Bcl-2 protein levels were reestablished at 12 hours and 24 hours respectively. Mcl-1 and Bak protein levels did not change. Bax was also upregulated similar to high dose treatment. Protein levels of Bim and Bid were also studied by immunoblotting and were not found to change.In our experimental system, several cell lines (huv-ec-c?s and U937 cells) and several Bcl-2 family proteins` levels (Among prosurvival; Bcl-2, Bcl-XL and Mcl-1, among proapoptotics; Bax, Bak, Bid, Bim) were studied in response to 4-HNE treatment. Shortly, Bcl-2 proteins mainly responded in cell specific manner. Among these proteins, in huv-ec-c`s Bcl-XL and Bax were upregulated, Bcl-2 was downregulated. In U937 cells, Bcl-XL and Bcl-2 were downregulated at early time points, Mcl-1 level remained the same whereas Bax was upregulated. Only Bak protein responded in dose dependent manner in monocytes. In order to enlighten the role of Bak in the apoptotic mechanism, further investigations are necessary.Finally, these results indicate the involvement of mitochondrial pathway and sequential activation of Bcl-2 family proteins in high and low doses of 4-HNE induced apoptosis in two different cell lines.