Possible anticancer effects of PMC-A through the mechanisms of mitochondrial apoptosis and cell cycle arrest in colon carcinoma cell lines; HCT116 WT and Bax (-/-)

Abstract

Laboratuvarımızın önceki çalışmalarında, Pramanisin'in (PMC) Jurkat lösemi hücrelerini apoptoza teşvik ettiği doza ve zamana bağlı olarak gösterilmiştir. Buna dayalı olarak, bu çalışmada, HCT116 kolon kanser hücrelerinde PMC ve 9 analoğunun olası anti-kanser etkileri belirlenmiş, etki mekanizmaları Bcl-2 protein ailesine ve hücre döngüsünden kaçışa odaklanılarak araştırılmıştır.M30 ve zamana bağlı Annexin V deneyleriyle gösterildiği üzere, taramaları yapılan 9 analog içerisinde PMC-A, HCT116 hücrelerini apoptotoza indükleyen en etkili kimyasaldır. Doz ve zaman kinetikleri, PMC-A'nın apoptoza indükleyen en etkili ajan olduğunu göstermiştir (25 ?M, ? 30%, 24 saat), bu nedenle, PMC-A ileriki deneylerde çalışılmak üzere seçilmiştir. Bax'ın apoptotik yolaktaki rolünü anlamak için HCT116 Bax(-/-) hücreler üzerinde de paralel deneyler gerçekleştirilmiştir. Bax(-/-) hücreleri 25 ?M PMC-A ile muamele edildiğinde, WT hücrelere kıyasla geç olarak apoptotik cevap 24. saatte gözlenmiştir. WT hücrelerde, kaspaz-9 aktivasyonu ve uyumlu olarak apaf-1 artışı zamana bağlı olarak gözlenmiştir. WT hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu gözlenmesine rağmen, HCT116 Bax(-/-) hücrelerde kaspaz-3 aktivasyonu gözlenmemiştir, bu durum belirtilen hücrelerde kaspaz-3'ten bağımsız bir apoptotik yolağa işarettir.Apoptotik cevabı daha ayrıntılı incelemek üzere, Bcl-2 protein ailesi üyelerinin düzenlenmesi (yaşam destekleyicilerden, Bcl-2, Mcl-1 ve Bcl-xL; apoptoz destekleyicilerden, Bax, Bak, Bim, Puma, Bad ve Bid) immünoblotlama tekniği ile zamana bağlı olarak incelenmiştir. Bcl-2 miktarı azalırken, Mcl-1 miktarı artmış ve Bcl-xL miktarı değişmemiştir. Diğer taraftan, apoptoz destekleyici proteinlerden, Bim, ve Bax miktarı artarken, Bak miktarı azalmış, Bad ve Puma miktarı sabit kalmıştır. WT hücrelerde miktarında değişim gözlenen yaşam destekleyici proteinlerden Bcl-2 ve Mcl-1 seviyeleri, Bax(-/-) hücrelerde kontrol edilmiştir, apoptotik yolakta Bax'ın öncesinde düzenlendiklerinden, beklendiği üzere anti-apoptotik proteinlerin patterninde bir değişim olmamıştır. Apoptoz destekleyici proteinlerden Bid, WT hücrelerde kesilirken Bax(-/-) hücrelerde kesilmemiştir.Hücre çoğalması ve ölümü arasındaki denge kanser gelişiminde önemli bir nokta olduğundan, PMC-A`nın hücre döngüsü üzerindeki etkisi belirlenmiştir. Genel siklin-bağlı kinaz engelleyici proteinlerden p21 miktarı WT ve Bax(-/-) hücrelerde artmıştır. WT hücrelerde hücre döngüsünün hiçbir fazında kaçış gözlenmezken, Bax(-/-) hücrelerde hücre döngüsünün G2-M fazında kaçış gözlenmiştir; bu durum Bax(-/-) hücrelerin hücre döngüsünden kaçma hassasiyetinin olduğuna işarettir.Verilerimiz göstermektedir ki PMC-A etkisi ile HCT116 WT hücreleri kaspaz aktivasyonu ve Bcl-2 düzenlenmesi ile iç apoptoz yolağına indüklemiştir, fakat bunun yanında Bax eksikliği programlanmış hücre ölümünün farklı bir yolak üzerinden gerçekleşmesine neden olmaktadır. Özet olarak, apoptoz PMC-A'nın HCT116 üzerinde baskın bir etkisidir; diğer taraftan Bax eksikliği PMC-A uygulanmış hücrelerin, hücre döngüsünden kaçma hassasiyetini artırmaktadır; bu durum apoptoza alternatif bir cevaptır.

In previous studies reported from our lab, pramanicin (PMC) induced apoptosis in Jurkat leukemia cells in a dose- and time-dependent manner; and this effect has been shown to be caspase dependent. Therefore, in this study, possible anticancer effects of PMC and its 9 analogs were determined; and further insight into the mechanism of action is provided by focusing on Bcl-2 family proteins and cell cycle arrest in HCT-116 WT and Bax(-/-) colon cancer cell lines.Among 9 analogs screened PMC-A was the most effective chemical in inducing apoptosis as shown by M30 and time-dependent Annexin V assays. Dose and time kinetics indicated that PMC-A was the most effective in inducing apoptosis (25 ?M, ? 30% in 24 hours), therefore, it was chosen for further experiments. To understand the role of Bax in apoptotic pathway, parallel experiments were carried out in HCT116 WT and Bax(-/-) cells. Compared to the WT cell lines, the apoptotic response of Bax(-/-) cells after the treatment with PMC-A at 25 ?M was detected at 24th hour indicating a late apoptotic response. Caspase-9 activation and apaf-1 up-regulation were observed consistently in a time-dependent manner. Although caspase-3 cleavage was observed in WT cells, there was no caspase-3 cleavage in HCT116 Bax(-/-) cells indicating a caspase-3- independent apoptotic pathway.To provide further insight into the apoptotic response, regulation of Bcl-2 protein family members (among pro-survivals, Bcl-2, Mcl-1 and Bcl-xL; among pro-apoptotics Bax, Bak, Bim, Puma, Bad and Bid) were monitored by immunoblotting in a time dependent manner. As Bcl-2 was down-regulated, Mcl-1 was up-regulated and Bcl-xL levels remained the same. On the other hand, among pro-apoptotic proteins, Bim and Bax was up-regulated, Bak was down-regulated, Bad and Puma levels remained constant. Since Bcl-2 and Mcl-1 were the regulated proteins among pro-survivals, their modulation in Bax(-/-) cells were determined. Their pattern did not change in comparison to WT cells, which can be explained by the upstream effect of these proteins. Among other pro apoptotic proteins, Bid was truncated in WT cells, whereas was not truncated in Bax(-/-) cells.Since equilibrium between cell proliferation and death has been proposed to be a fundamental point in carcinogenesis, effect of PMC-A on cell cycle was identified. There was an increase in p21 level, a general inhibitor protein, in both cell types; WT and Bax(-/-). WT cells did not arrest at any phases of the cell cycle, however, Bax(-/-) cells arrested at G2-M phase, indicating a sensitive profile of Bax(-/-) cells to cell cycle arrest.Our data indicate that PMC-A induced intrinsic apoptosis pathway, triggering caspase-cleavage and Bcl-2 regulation in HCT116 WT cells, whereas Bax deficiency induced a different pathway in programmed cell death response. In summary, apoptosis is a dominant effect of PMC-A in HCT116 cells, on the other hand Bax deficiency made cells more sensitive to PMC-A induced cell cycle arrest indicating alternative response to apoptosis.