Reagent-free covalent crosslinking of chitosan-gelatin films for medical applications

Abstract

Kitosan-jelatin compozit bazlı filme; esneklik, mekanik dayanıklılık ve bağlantılıporozite gibi istenilen özellikleri katmak için reaktifsiz moleküler arası kovalent çaprazbağlama tekniği geliştirilmiştir. Biyomateryal ile kimyasal reaktifin herhangi bir temasısonucu ortaya çıkan güvenlik tehlikesinden dolayı, reaktifsiz bir metot geliştirilmesininana amacı; biyomateryal fabrikasyon sürecinde ki zararlı fiziyolojik etkilere yol açankimyasal reaktif uygulaması adımını atlamaktır. Bu çalışmada, doğal olarakantimikrobiyal ve biyodegrade edilebilir özellikte kitosan-jelatin kompozisyonlarkullanılmıştır. Bu çalışmada, gözenekli yapıya sahip çapraz bağlı materyal elde etmeküzere; kitosan-jelatin filmler liyofilizat formunda hazırlanmıştır ve susuz vakum şartlarıaltında ısı muamelesi yapılmıştır. Hücre prolifirasyon testleri için materyalin uygunmekanik özellikleri, morfolojisi, porozitesi ve bağlantılı gözenek yapısı; bileşenlerinbaşlangıç konsantrasyon/oranları ve deney şartları optimize edilerek sağlanmıştır.Materyalin yapısında ısı uygulaması sonrasında, spektroskopik analiz sonucu amitgruplarının hidrojen bağlarında zayıf fakat belirgin değişiklikler saptanmıştır. Kovalentbağ oluşumu doğrudan tespit edilmemesine rağmen, materyalin PBS tampon çözeltisiiçerisindeki belirgin şişmesinden ve destrüktif olmayan indirgen şartlar altındaçözünmemesinden dolayı moleküler arası çapraz bağlanma oluşumu sonucunavarılabilir. Aslında bu işlemin, sulu ortamda ve proteolitik şartlar altında filmin uzunsüreli stabilitesini yüksek derecede arttırdığı bulunmuştur. Film üzerinde ve çevresindemikrobiyal büyüme gözlemlenmediğinden dolayı, işlenmiş filmin kitosana aitantimikrobiyal özellikleri koruduğu sonucuna varılabilir. Mekanik testler sentezlenenmateryalin hidratasyonu sonrasında, çapraz bağlı yumuşak biyomateryalden beklenendüşük yüklenme uygulamaları için uygun esneklik ve germe direncine sahip olduğunugöstermiştir. In vitro hücre kültürü testleri, filmin yüzeyinde ve gözeneklerin içindehücre adhezyonunun uygun olduğunu göstermiştir ve filmin içindeki proliferasyonunfilmin biyodegredasyonuyla paralel olarak gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. Sonolarak, hemoglobin aynı yöntem kullanılarak çapraz bağlı kitosan-jelatin filmlerüzerinde immobilize edilmiştir ve oluşan filmlerin oksijen bağlama aktivitesine sahipolduğu tespit edilmiştir. Immobilize hemoglobinin katalitik aktivitesini koruması, buçapraz bağlama tekniğinin ılımlı şartlar sağladığını bir kere daha doğrular. Bu olumluverilere dayanarak, reaktifsiz kovalent çapraz bağlama yöntemiyle elde edilenmateryalin, tıbbi uygulamalarda genelde kullanılan bir çok yumuşak biyomateryale göredaha güvenli, uygun alternatif oluşturabileceği sonucuna varılır.

A reagent-free, inter-molecular covalent crosslinking technique was developed in orderto incorporate desirable traits such as flexibility, mechanical robustness and highinterconnective porosity into composite chitosan-gelatin base films. Since any form ofcontact between biomaterials and reactive chemicals typically raises safety concerns,the principle goal in developing a reagent-free method was to bypass all adversephysiological effects that might otherwise be induced by some reactive chemical step inthe processing history of the biomaterial. Intrinsically antimicrobial and biodegradablechitosan-gelatin compositions were targeted. To being, chitosan-gelatin films wereprepared in lyophilisate format and heat-treated under dehydrative vacuum conditions,yielding crosslinked porous materials. The mechanical properties, morphology, porosityand pore interconnectivity of this material were fine-tuned by varying the startingcomposition and experimental conditions, eventually yielding a product amenable tocell proliferation tests. Structural changes of the material were spectroscopically probedafter heat application, revealing subtle but general alterations in the hydrogen-bondingof amide groups. While new covalent bonds were not established by direct observation,minor inter-molecular crosslinking could be concluded from the observable swelling ofthe material in PBS buffer and its inability to re-dissolve under the most stringent ofnon-destructive reducing conditions. In fact, dehydrothermal processing was found tohave dramatically improved the long-term stability of the film in aqueous media, evenunder proteolytic conditions. Processed films also retained the antimicrobial traits ofchitosan, as evidenced by the lack of visible growth within the film and surroundingmedia. Mechanical tests implied that the dehydrothermally-crosslinked films, once rehydrated,possessed the necessary flexibility and tensile strength to potentially assumemany of the minor-load applications expected of chemically crosslinked softbiomaterials. Typical in vitro cell culture studies showed good adhesion of cells alongthe surface and within the pores of the film, with sub-surface proliferation apparentlybeing aided by the concomitant and gradual biodegradation of the film structure.Finally, hemoglobin was dehydrothermally immobilized to these crosslinked chitosangelatinfilms, yielding a catalytically active oxygen-loading film and further attesting tothe benign nature of this crosslinking technique. Based on these positive outcomes, itfollows to reason that reagent-free covalent crosslinking may conveniently yieldsuitable and safer alternatives to many soft biomaterials commonly used in medicalapplications.