Trichoderma reesei as an expression system for homologous production of individual cellulases

Abstract

Selülazlar atıl durumdaki çok büyük miktarlardaki biyokütlenin geleceğin en etkili alternatif enerji kaynağı adayı olan mayalanabilir şekere dönüştürülmesi için elzem bir işlem olan selülozun glukoza hidrolize edilmesini sinerjik olarak katalize edebilen bir grup enzimdir. Enzimlerin saflaştırılması zor ve zaman isteyen bir işlem olduğu için, farklı bileşenlerin belirli oranlarda karışımını gerektirebilecek bu uygulamalar için enzimlerin tek tek üretilmesi daha tercih edilirdir.Bir ipliksi mantar türü olan Trichoderma reesei'nin selülazların tek tek üretimi için bir ekspresyon sistemi olarak değerlendirilmesi amacıyla Endoglukanaz I (EG1/Cel7B), Endoglukanaz III (EG3/Cel7A) ve Sellobiyohidrolaz I (CBH1/Cel7A) enzimleri selülaz-negatif bir mutant olan delta-xyr1 soyunda, glukozlu ortamda yüksek aktivite gösteren iki farklı promotor (tef1 ve cdna1) kullanılarak homolog olarak üretildi. Literatürde ilk defa bu tezde münferit selülaz bileşenleri (EG1, EG3 ve CBH1) selülaz-negatif bir T.reesei soyunda, indükleyici olmayan koşullarda, aktif halde yüksek miktarda başarılı bir şekilde üretildi. cbh1 promotoruyla EG1 ve EG3 enzimlerinin daha yüksek miktarda üretilebildiği gözlendi. Yanı sıra, T.reesei bir ekspresyon sistemi olarak tesis edildi ve ilerideki uygulamalar için kullanılabilecek şekilde kısmi olarak optimize edildi.

Cellulases are a group of enzymes that can synergistically catalyze hydrolysis of cellulose into glucose, which is an essential process for conversion of huge amounts of dormant cellulosic biomass into fermentable sugar, one of the most potent alternative energy sources of the new world. Since purification is difficult and time-consuming, production of cellulases individually is more favorable for these applications that may require specific combination of different enzyme components.In order to evaluate the filamentous fungus Trichoderma reesei as an expression system for production of individual cellulases, Endoglucanase I (EG1/Cel7B), Endoglucanase III (EG3/Cel12A) and Cellobiohydrolase I (CBH1/Cel7A) were homologously expressed in the cellulase-negative mutant strain delta-xyr1 using two alternative promoters (tef1 and cdna1) on glucose medium. In this thesis we show that individual cellulase components (EG1, EG3 and CBH1) could be successfully overexpressed in active form in a cellulase negative T.reesei background under non-inducing conditions for the first time in the literature. We also show that cdna1 promoter resulted in higher expression levels of EG1 and EG3. Additionally, T.reesei was established and partially optimized as an expression system which can be employed for future applications.