Identification and functional analysis of an autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat under biotic (Fusarium culmorum) and abiotic (Drought) stress conditions

Abstract

Kendi kendini yeme anlamına gelen otofaji, sitoplazma içeriğinin kofullarda ya da lizozomlarda parçalanmasını amaçlayan, evrimsel olarak korunan katalitik bir süreçtir. Daha önce maya, memeli ve bitkilerde tespit edilen otofajinin indüklenmesi ile sitoplazmik bileşenleri içeren çift zarlı, otofagozom adı verilen yapı, kofullara veya lizozonlara yönlendirilir. Tanımlanmış 30 otofaji geninin arasında en yaygın olarak çalışılan Atg8 geni otofagosomların oluşturulmasında görev almaktadır. Otofajinin; açlık, oksidatif stress, tuz stresi, ozmotik stres gibi çevresel stres koşullarında aktive olduğu belirlenmiştir. Bu çalışmada, bilgimiz dahilinden ilk defa, yabani buğdayın Atg8 geni tanımlanmış, TdAtg8 olarak isimlendirilmiş ve otofajinin abiotik ve biotik stres koşullarındaki rolü incelenmiştir. TdAtg8 geninin ifade profilinin incelenmesi ile, kuraklık koşulları altında TdAtg8 geninin özellikle köklerde daha çok ifade edildiği belirlenmiştir. Otofagozomların incelenmesi için, bitki çalışmalarında kullanılan, ?Monodansylcadaverine? (MDC) ve ?Lysotracker? kırmızısı isimli iki ayrı boyadan yararlanılmıştır. Otofagozomların boyanması ile otofajinin temel hücrelerde de aktif olduğu, kuraklık koşullarında ise indüklendiği tespit edilmiştir. TdAtg8 geninin, mutant maya hücrelerine aktarılması ile TdAtg8 geninin maya Atg8 geni ile ortolog olduğu ve fonksiyonel olarak mayada otofajinin aktive olmasını sağladığı gözlenmiştir. TdATG8 proteini mayada ifade edilmiş ve ?western blot? yöntemi ile analiz edilmiştir. Yabani buğdayın TdAtg8 geni, virus indüklenmesi ile gen susturma yöntemi kullanılarak susturulmuş ve otofajinin Fusarium culmorum isimli bitki patojeninin varlığında nasıl görev aldığı belirlenmiştir. Yapılan analizde, susturulmuş bitkilerde mantar sporlanmasının çok daha az olduğu gözlenmiştir. Sonuç olarak, TdAtg8 geninin susturulması halinde, bitkinin patojene karşı daha dayanıklı hale geldiği tespit edilmiştir.

Autophagy, literally self eating, is an evolutionary conserved catalytic process for vacuolar degradation of intracellular components, previously examined in yeast, mammals and plants. Abiotic stress factors, including nutrient starvation, oxidative stress, salt stress and osmotic stress have been previously reported to induce autophagy in plants. In this study, for the first time, Atg8 gene was cloned from wild emmer wheat (TdAtg8) and the role of autophagy under biotic and abiotic stress conditions was investigated. Examination of TdAtg8 expression patterns indicates that Atg8 expression was immensely upregulated under drought stress, especially in the roots. Monodansylcadaverine (MDC) and Lysotracker Red markers utilized to observe autophagosomes revealed that autophagy is constitutively active in T.dicoccoides. Moreover, autophagy was determined to be more active in plants exposed to drought stress when compared to plants grown under normal conditions. TdAtg8 gene was demonstrated to complement Atg8 yeast mutants grown under starvation conditions in a drop test assay. For further functional analysis, ATG8 protein from T. dicoccoides were expressed in yeast and analyzed with western blotting. TdAtg8 was also silenced in wild emmer wheat by virus-induced gene silencing and its role was investigated in the presence of a plant pathogen, Fusarium culmorum. This response, for the first time, showed that fungi sporulation decreased in Atg8 silenced plants in comparison to controls. Based on the data obtained, we conclude that the plants become more resistant against the plant pathogen when the autophagy was inhibited.