Durum wheat metallothionein mutants and their biophysical characterization

Abstract

Metallotioninler (MT'ler) düşük moleküler ağırlıklı olup bünyelerinde bulundurdukları çok sayıdaki sistinler sayesinde metal bağlama özelliğine sahiptirler. MT'ler yaklaşık 50 yıl önce at böbreklerinde kadmiyuma bağlanan proteinler olarak keşfedilmişlerdir. Hemen hemen tüm organizmalarda bulunan MT'ler filogenetik ilişkileri ve sistin gruplarının dağılım düzeni dikkate alınarak sınıflandırılmıstır (Binz & Kagi, 2001). Çeşitli metallere d10 elektronik konfigürasyonu ile bağlanırlar (Vasak & Hasler, 2000).Bu çalışmada Triticum durum (makarnalık buğday) tip 1 bitki metallotioninin amino asit dizisindeki sistin gruplarının dağılım düzeninde mutasyonlar yapılmış ve bu mutasyonların proteinin metal bağlama kapasitesi üzeirndeki etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla dMT'deki Sistin-X-Sistin motifleri tek ve çift mutasyonlarla değiştirilmiştir. Çift (G61CG65C) ve tek (G8C, G12C, G61C, G65C) mutantlar hedefli mutasyon protokolü ile elde edilmiştir. Önceki çalışmalara dayanılarak (Bilecen ve ark., 2005) mutant proteinler E.coli'de GST'ye (glutatyon-S-transferaz) ekli şekilde sentezletilmiştir. Füzyon proteini mutant GSTdMT ve dMT saflaştırılmış, bu proteinlerin yapısal özellikleri ve metal bağlama özellikleri biyofiziksel yöntemlerle incelenmiştir. (Afinite ve moleküler elek kromatografisi, SDS-natif poliakrilamid jel elektroforezi, sınırlı trypsinolisis, atomik emilim spektroskopisi, ultraviyole ve görünür ışık absorpsiyon spektroskopisi, sirküler dikroizm spektrofotometresi, dinamik ışık saçılımı ve solüsyon X-ışını saçılımı ölçümü).G8C, G12C, G61C ve G65C mutantları sentezletilmiş ve proteinler biyofiziksel karakterizasyon için saflaştırılmıştır. Öte yandan çift mutant G61CG65C çözünebilir E. coli fraksiyonlarında da inkluzyon cisimciğinde de tespit edilememiştir. Sentezletilebilen tekli mutantlar homodimer olarak saflaştırılmış ve verimleri 1 litre bakteri kültürü için 10-15 mg olarak tespit edilmiştir. Proteinlerin Cd bağlayıcı özelliğinin göstergesi ultraviyole ve görünür ışık absorpsiyon spektroskopisindeki 250 nm omuzdur. G8C, G12C ve G61C mutant proteinlerin Cd2+/protein oranı 3.5 ± 1'tir aynı yerli GSTdMT gibi. Ancak G65C mutantında protein başına 4.4 Cd2+ oranında bağlayıcı özellik tespit edilmiştir. Bu demektir ki G65C mutantı, yerli GSTdMT ile karşılaştırıldığında, bir mol protein için fazladan bir mol Cd2+ bağlayıcı bir özellik geliştirmiştir. G65C'nin proteolitik bölünme sonucuna göre bu mutant yerli GSTdMT'ye göre daha kompakt bir yapıya sahiptir. Solüsyon X-ışını saçılımı ölçümü sonuçlarına göre de G61C ile yerli GSTdMT'nin yapısının benzer olduğunu gösterilmiştir.Bu çalışmada elde edilen G65C mutantı MT'lerin Cd bağlayıcı mekanizmalarının araştırılması ve MT'lerin biyosensör uygulamalarında kullanılması için bir imkan sunuyor. Geliştirilmiş Cd bağlama kapasitesinin anlaşılması ve bu özelliğin protein GST'den ayrıldıktan sonra korunup korunmadığının araştırılması için çalışmalara devam edilecektir.

Metallothionein (MT) proteins are characterized as low molecular weight, cysteine (Cys)-rich, metal binding proteins that were discovered more than 50 years ago as Cd-binding proteins present in horse kidney. They have been found in wide range of organisms and their classification was based on the phylogenetic relationships and patterns of distribution of Cys residues along the MT sequences (Binz & Kagi, 2001). They bind a variety of metals with d10 electronic configurations through mercaptide bonds with Cys residues (Vasak & Hasler, 2000).In the present study effects of mutations of Cys residue distributions on the metal-binding properties of a Cd-binding type 1 MT from Triticum durum are investigated. For this purpose, modifications were introduced to the cys-motifs of the native durum MT, dMT. Double (G61CG65C) and single mutants (G8C, G12C, G61C, G65C) were produced by site-directed mutagenesis Based on results from earlier work (Bilecen et al., 2005) mutants were expressed in E. coli as glutathione-S-transferease (GST) fusion proteins. Proteins were purified and characterized by affinity and size exclusion chromatography, SDS- and Native-PAGE, limited trypsinolysis, inductively coupled plasma optical emission spectroscopy (ICP-OES), UV-Vis absorption spectroscopy, circular dichroism spectropolarimetry (CD), dynamic light scattering (DLS), and small-angle X-ray scattering (SAXS).Expression of the mutants G8C, G12C, G61C and G65C was stable and the proteins were purified for biophysical characterization. Expression of the double mutant G61CG65C, on the other hand, could not be detected in the soluble E. coli fractions and efforts to locate it in inclusion bodies also failed. All the over-expressed mutants were purified as homodimers in solution. Protein yield for the mutant preparations ranged between 10 to 15 mg per liter of bacterial culture. The UV-Vis absorption spectra for all the mutants displayed the typical shoulder at 250 nm indicating Cd-binding. The G8C, G12C and G61C mutants had a Cd2+ to protein ratio of 3.5±1 which is similar to that observed with native GSTdMT. The G65C, however, showed enhanced Cd binding with a ratio of 4.4 Cd2+ per protein, thus binding an additional Cd for each mole of protein compared to native GSTdMT. Proteolytic cleavage results of the G65C indicated that this mutant has more compact structure compared to native GSTdMT. Shape models obtained from SAXS data of G61C showed that the shape envelope of this mutant is similar to that of the native GSTdMT.G65C mutant obtained in during these studies offers a possibility for investigation of the Cd-binding mechanisms of MTs and for designing MTs that can be used in applications including biosensors. Future work is needed to understand the basis of enhanced Cd-binding capacity and to determine if this property is preserved when the protein is cleaved from its GST partner.