Protein engineering of rhizopus oryzae lipase for improved thermostability

Abstract

Protein mühedisliği yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak için kullanılan araçları temin eder ve bu ilişkiyi yöneten kuralları ortaya çıkarır. Enzimler muhtelif birçok reaksiyon katalizasyonunda rol alırlar ve tekstil endüstrisiden ilaç endüstrisine kadar geniş bir dizi uygulamada kullanılırlar. Günümüzde biyoteknoloji endüstrisinin en önemli konularından biri kimyasalların yerini enzimlerin almasını odaklamaktadır. Özellikle lipazların bu tür işlemlerde büyük önemleri vardır. Fakat mevcut aktif lipazlar endüstriyel uygulamaların gerektirdiği olağandışı koşullarda örnekle yüksek sıcaklık ve aşırı pH koşularında fonksiyon kaybı göstermektedirler. Bu nedenle bu tez çalışmasında Rhizopus oryzae lipazının yüksek sıcaklıkta kararlı hale getirilmesini ve bu sırada aktivitesini korumasını sağlayarak termokararlığı üstüne kurallar çkarılmasına yoğunlaşılmıştır. Öncelikle yararlı nokta mutasyonları tahmin eden hesaplamaya dayalı bir analiz içeren protokol geliştirilmiş ve tahmin edilen mutasyonların etkileri in silico analiz edilmiştir. Daha sonra bu tahminleri doğrulamak amacı ile mutant proteinler önce gen seviyesinde klonlanmış, ekpress edilmiş ve ardından saflaştırılmıştır. Sonucunda Rhizopus oryzae lipazindaki P195G mutasyonun proteinin tabi haline kıyasla yüksek sıcaklıkta aktivitede yüzde 80.5 daha fazla muhafaza sağladığı gözlemlenmiştir.

Protein engineering provides tools for understanding the structure function relationship and deduces the rules governing this relationship. Enzymes catalyze several types of reactions and have wide range of applications ranging from the textile industry to the pharmaceutical industry. Today one of the most important topics in biotechnology industry focus on replacing chemicals with enzymes accordingly turning all the industrial processes into green industry. Especially lipases have great importance in such processes. Unfortunately currently available active lipases do not function well under the harsh industrial conditions such as high temperature and extreme pH. In this thesis I have focused on the thermostability of Rhizopus oryzae lipase and tried to deduce the rules that make it stable at high temperatures while preserving their activity. I have developed a protocol involving the computational analysis predicting beneficial point mutations, and analyzed the effects of predicted mutations in silico. I have cloned, expressed and purified the mutant proteins to verify the predictions. I showed that the P195G mutation in Rhizopus oryzae lipase sustained 80.5 percent of the activity at high temperatures in comparison to the native lipase.