Toward anti-cancer drugs: Selection of anti-VEGF and anti-HER2 aptamer to inhibit cancer biomarkers

Abstract

Yaklaşık 71 tane kanser tipi vardır ve bu kanser tiplerinin çoğunluğu karma bir yapı gösterirler. Bu nedenle, her kanser tipi için ortak olan fizyolojik değişikler üzerinde çalışmak kanser tedavileri için başarılı bir yaklaşım olabilecektir. Çoğalma sinyalinin geliştirilmesi ve damar gelişiminin fazlalaşması kanser gelişimine sebep olan birçok mekanizma arasında yer alıyorlar. HER2 and VEGF proteinlerinin ekspresyonları yukarıdaki mekanizmalarda, sırasıyla, artmaktadır. Bu nedenle bu çalışmanın amacı yukarıda bahsedilen proteinlere bağlanarak onların fonksiyonlarını engelleyecek olan sentetik tek zincirli DNA molekülleri (aptamer) üretmektir. Bu biyoişaretleyiciler için literatürde aptamerler bulunmakta olsa da, bu calışmada amacımız farklı potansiyeli olan yeni aptamerler seçmektir. Bu spesifik aptamerler, magnetik boncuklar üzerinde hareketsiz bulunan HER2/VEGF proteinler kullanılarak SELEX (Üstel Zenginleştirme aracılığıyla Ligandların Dizgeli Gelişimi) teknolojisi ile geliştirilmiştir. Bunun için zenginleştirilmiş tek zincirli DNA havuzu oluşturulmuş, klonlanmış ve DNA dizi analizi yapılmıştır. Anti-VEGF aptamerinin ilginç bir özelliği tesbit edilmiştir ki bu da G-dörtlü yapıya sahip olması ve bu yapı sayesinde VEGF proteinine spesifik olarak bağlanma özelliğinin bulunmasıdır. Buna karşılık HER2 aptameri iki gövdeli bir yapıya sahiptir ki bu özelliğide HER2 proteinine bağlanmasında rol oynayabilir. Anti-VEGF aptamer ile ilgili yapılan bağlanma dengesi analizleri Kd (çözünme sabiti) değerini 315 nM göstermiştir.Bu değer VEGF proteinine karşı sıkı bir bağlanma eğilimini gösterir.Bunun yanında anti-HER2 aptameri Kd değerini yaklaşık 309 nM göstermiştir ki bu da zayıf bir bağlanma eğilimine işaret eder. Bu çalışmada insan serumu ile karşı seçim aşamaları kullanılmış, böylece aptamerlerin seçiciliğinin artırılması amaçlanmıştır. VEGF proteinine bağlanan aptamerler çeşitli biyotanıma teknolojileri kullanılarak kanserin kanda teşhisinde kullanılabilirler.

There are ~71 cancer types and most of them exhibit heterogenous phenotypic characteristics. For this reason, studying common physiological alterations in cancer cells can be a successful approach for cancer treatment. Sustaining proliferative signaling and inducing angiogenesis are two of the many acquired characteristics during cancer progression. Both HER2 and VEGF are overexpressed in each of the above conditions, respectively. Therefore, the aim of this study is to develop synthetic ssDNA molecules (aptamers) that can bind to HER2 and VEGF, and inhibit their function, respectively. Even though there are already aptamers for these two targets, we wanted to select our aptamers for which there exist the possibility to bind with higher affinity. These aptamers were developed by using SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) technology in which HER2/VEGF immobilized magnetic beads were employed for the selection of specific aptamers. The enriched ssDNA pool was cloned, sequenced and characterized. The chosen anti-VEGF contained a G-quartet, while anti-HER2 contained a two stem-loops in their structure. We speculate that these features may play a role in specific binding to the target protein. Equilibrium binding assays with anti-VEGF aptamer showed a dissociation constant (Kd) of 315 nM and anti-HER2 showed a Kd of 309 nM. Despite the similar binding, anti-HER2 was less selective toward its target protein. In this study we incorporated the counter selection step toward human serum to exclude the serum proteins binders. The anti-VEGF can potentially be used to detect cancer in blood by using biosensing technologies.