Redistribution of states and inducing new channels for conformational change: Computational studies on calmodulin

Abstract

In vitro deneyleri proteinlerin büyük yapısal değişim geçirebilmelerinin `nadir bir olay` olduğunu ve bu olayların zaman ölçeğinin microsaniye olduğunu göstermiştir. Birden çok fonksiyonu gerçekleştirebilen proteinlerin, çevresel koşullarının değiştirilmesi ile in vivo ortamda yapısal değişimi kolaylıkla geçiriyor olabilmesi zorunludur. Bu çalışmada kalsiyum yüklü kalmodulin (Ca2+-CaM) örneğini kullanarak, proteinin etkileşim ortamında uygulanan zorlamalara verdiği tepki ile baska bir konformasyona geçişinin kolaylaştırılmasını inceliyoruz. Zorlama olarak, (i) tek bir amino asidin mutasyonu (ii) düsük pH etkisini göstermek için bir grup amino asidin protonlaması (iii) sistematik olarak seçilen amino asitlere sarsım verilmesi (iv) sistematik olarak seçilen amino asitlere öteleme verilmesi (v) proteinin içinde bulunduğu solventin iyonik kuvvetini arttırmak olmak üzere beş farklı tip kullanılmıştır. Zorlama uygulanmış sistemlerden (i) ve (ii)' nin moleküler dinamik benzetimleri yapılmış ve deneysel koşullarda microsaniye zaman ölçeğinde gözlemlenen değişimin onlarca nanosaniye zaman ölçeğinde gerçekleştiği gözlemlenmiştir. Özellikle, E31A mutasyonu ile açık ve kapalı yapılar arasında tersinir geçiş sağlanabilmiştir. Bu yapı, bağlantı helisinin bükülmesi ile kapalı hali almıştır ve bu durum ligand bağlı yapılarda gözlemlenen ile aynıdır. Bir grup amino asidi protonlamak da 100 ns zaman ölçeğinde gercekleşebilen bir yapısal değişime yol açmaktadır. Bu durumda ulaşılan yapı kapalıdır ve bağlantı helisinde bükülme gözlenmemiştir. Ayrıca, bu yapı floresans rezonans enerji transferi (FRET) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) deneysel verilerinden elde edilmiş yapılar ile uyumludur. Açık ve kapalı yapılar arasındaki enerji bariyerinin geçilebilmesi ki deneysel koşullarda `nadir bir olay` olarak tanımlanır, iki lob arasindaki itici elektrostatik etkileşimler kapatıldığı için gerçekleşebilmiştir. Bu değişim, ya düşük pH daki etkinin bir sonucu ya da N lobda bulunan amino asitler arası oluşan alosterik etkileşim ile C lobu etkilemesi sonucu olabilmiştir ((iii) ve (iv) zormalarinin sonucu ile de gösterilmiştir). En sonuncu zorlama senaryosu olan (v), protein'in bulunduğu ortamın iyonik kuvvetinin arttırılması durumunda, protein'e yakın olarak duran iyon sayısında azalma olduğu gözlemlenmistir. Bu durum bağlantı helisinde bulunan amino asitlerin salınımlarını sertleştirmiş ve protein yapısının salınım dinamiğini yavaslatmıştır. Ca2+-CaM açık yapısında sistematik olarak amino asitlere sarsım uygulanması (iii) kuvvet olarak ya da (iv) öteleme olarak birbirini tamamlayıcı sonuçlar vermiştir. İki yaklaşımda proteinin yapısal değişimini tetikleyen amino asitlerin protein üzerinde aynı bölgelerde olduğunu göstermektedir. Yerel kuvvet metodu yüklü amino asitleri, yerel öteleme metodu ise polar ve hidrofobik amino asitleri aynı bölgede bulmaktadır. Her iki yaklaşımda yapılan gözlemler iki lob arasında allosterik iletişim evrenselliğini teyit ederken, iki metodun farkli tipteki amino asitleri bulması metodların optimize termodinamik fonksiyonlarındaki farklılıkları yansıtmaktadır.

In vitro experiments demonstrate that large conformational changes in many proteins are observed as `rare events` occurring on microsecond timescales. For proteins that sustain a plethora of functions, it is imperative that different conformational states be achieved readily under slightly differing environmental conditions in vivo. We investigate how perturbations that may be experienced by proteins in their fluctuating environments may be invoked to facilitate their access to different micro states, using the example of calcium loaded calmodulin (Ca2+-CaM). As perturbations, we introduce (i) mutation of a single residue, (ii) protonation of a group of residues to mimic the low pH environment, (iii) external forces applied on single residues, (iv) external displacements applied on single residues, and (v) increasing the ionic strength (IS) of the solution the protein resides in. After performing molecular dynamics simulations on the perturbed systems (i) and (ii), we observe distinct conformational changes within tens of nanoseconds, that otherwise occur on the time scales of microseconds. In particular, a reversible change between the extended and compact Ca2+-CaM structure may be invoked via the E31A mutation. This compact form bears a bent linker which is observed in many of the ligand bound forms of Ca2+- CaM. Protonation of ten acidic residues also leads to a large conformational change on the time scale of 100 ns. The structure attained is compact and although it does not have a bent linker, it is compatible with fluorescence resonance energy transfer and nuclear magnetic resonance experimental data. Barrier crossing between extended and compact forms of CaM, which is normally a rare event, is facilitated by shielding the repulsive electrostatic interactions between the two lobes. This is due to either the impact of lowering the pH in the environment or to allosteric interactions originating on the Nterminal domain and detected in the C-terminal domain as implicated by from the results of (iii) and (iv). We further find using scenario (v), at high IS there is depletion in the number of ions residing in close proximity of the protein. The loss of ionic screening results in rigidification of the linker fluctuations, leading to the slowing down of the dynamics of the system. Application of external perturbations to extended Ca2+- CaM in the form of forces (iv) as opposed to displacements (v) yield complementary results. We find that both approaches designate the same two regions on the protein structure, making these regions potential sites for manipulating conformational change. Local force perturbations implicate charged residues while local displacement perturbations find polar and hydrophobic residues in the same two regions. The observations reflect the differences inherent in the thermodynamic functions optimized by the two approaches, while confirming the universality of allosteric communicationbetween the two lobes.