Mapping intracellular immune responses against lentiviral vectors in natural killer cells using genome scale CRISPR knockout

Abstract

Günümüzde genetik olarak programlanmış hücrelerin tedavi amaçlı kullanımıyla ilgili yapılan araştırmalarda umut verici gelişmeler yaşanmaktadır. Bu çalışmalarda yaşanan en büyük zorluklardan biri yeni genetik materyalin hedef hücreye nasıl sokulacağıdır. Klinik denemelerde ve laboratuvar modellerinde, insan hücrelerine gen aktarımı üzerine yapılan çalışmalarda viral vektörler sıklıkla kullanılmaktadır. Ancak hücrelerin viral vektör girişini tespit ederek tetikledikleri hücre içi doğal bağışıklık cevaplarını yöneten sinyal yolakları konusunda bilgimiz sınırlıdır. Yeni Nesil Dizileme (YND) teknolojisindeki gelişmeler ile birlikte, bu hücresel değişikliklerin genom düzeyinde etkilerini saptayabilmek mümkün hale gelmiştir. CRISPR/Cas9 sistemi ile yapılan genom düzeyinde çalışmalar henüz yeni olsa da önemli bir potansiyel taşımaktadır. Bu çalışmada CRISPR/Cas9 sistemiyle genom düzeyinde değişiklik yapma stratejisi kullanılarak Doğal Öldürücü (NK) hücrelerin lentiviral vektörlere moleküler düzeyde verdiği cevapların bir haritası çıkarılmaya çalışılmıştır. NK hücreleri doğal bağışıklık sisteminin bir parçası olup virüslere karşı savunmada önemli rol üstlenen hücrelerdir. NK hücrelerini immunoterapi amacı ile kullanmak yeni bir düşünce olmamakla birlikte, bağışıklık sistemi hücresi olması sebebiyle virüslerin girişine karşı üst düzeyde koruması olan bu hücreleri lentiviral vektörler ile genetik olarak programlamak oldukça zordur. Bu tez çalışmasında CRISPR tabanlı, genom ölçekli gen susturma kütüphanesi olan GeCKO kullanılarak NK hücrelerin lentiviral vektörlere verdiği cevaplar tespit edilmeye çalışılmıştır. Yapılan kontrollü deney kurgusu sayesinde daha önce başka hücre gruplarında RNA virüslere karşı aktif olduğu gösterilen RIG-I/MDA-5 tip1 interferon sinyal yolağının yanında TLR sinyal yolakları da öne çıkan aday mekanizmalar olarak gösterilmiştir. Bu olası mekanizmalara ek olarak S100A12, APOB ve BCL10 gibi daha önce NK hücrelerde viral vektör girişi ile ilişkilendirilmemiş genler de yeni sinyal yolaklarının olabileceğine dair ipucu vermektedir. Etkili olan genlerden yola çıkılarak yapılan yolak analizi ile olası savunma mekanizmasının detayları ortaya çıkarılabilecektir. Tespit edilen sinyal yolaklarında hücre içinde yapılabilecek olası değişiklikler ile hücrelere gen aktarımı verimliliği arttırılabilecek, hücreleri tedavi amaçlı daha güvenli ve daha verimli programlayabilmek mümkün olabilecektir.

The use of genetically modified cells for therapeutic purposes is an increasing trend that shows great promise. The major hurdle in genetic modification of human cells is the delivery of the gene-of-interest into the cell. Currently, viral vectors are most commonly used for ex vivo genetic modification of human cells but there's very little information about the intracellular immune response pathways triggered by viral vector entry. With the help of advancing next generation sequencing technologies, genome-wide loss-offunction screens have the capacity to produce crucial data to enlighten several unknowns and characterize function of genes comprehensively. The CRISPR/Cas9 system was recently adapted into genome-wide screens and shows great potential in characterizing complex phenotypes. In this study, we used the efficient and high throughput genome editing ability of CRISPR/Cas9 system to discover NK cell resistance mechanisms to lentiviral gene delivery. NK cells are part of innate immune system that act as a first line of defense against viruses. Using NK cells as an immunotherapy agent is not a new idea but genetic modification of NK cells using lentiviral vectors is a very tough task due to its fully armed nature against viral agents. In order to reveal which antiviral pathways become triggered in NK cells during viral vector entry to the cell, we used Genome-scale CRISPR Knock-Out Libraries(GeCKO). Using a controlled experiment setup; we were able to identify candidate pathways like RIG-I/MDA5 type I interferon secretion and also Toll like receptor (TLR) related pathways that may block virus entry as well as mechanisms that are used by lentiviral vectors to manipulate host cells. Also several genes, like S100A12, I BCL10 and APOB were shown significantly changed during viral vector entry, which implicate some novel pathways in NK cells against lentiviral vectors. Mapping these pathways is the first step in the venture of overcoming the intracellular defense mechanisms against gene delivery vectors. Identification and manipulation of these pathways could lead to a dramatically increased delivery rate of the transgene, making gene therapy protocols safer and more effective. This may have broad technical applications in order to improve the efficiency of genetic modification of a wide variety of cell types.