Toplam tiyol tayini için yeni bir spektrofotometrik yöntem geliştirilmesi

Abstract

Biyotiyoller, insan vücudunda fizyolojik ve biyokimyasal süreçte önemli rol oynamaktadırlar. Hücresel tiyol seviyesindeki anormal değişimler Alzheimer, diyabet, AIDS, kardiyovasküler hastalıklar ve kanser gibi birçok hastalıkla bağlantılıdır. Bu yüzden, biyotiyolleri kantitatif olarak belirleyebilen yöntemlerin geliştirilmesi hastalıkların oluşumunu önlemek açısından son derece önemlidir. Bu tez çalışmasında, biyotiyollerinin spektrofotometrik tayini için modifiye ABTS-Persülfat yöntemi geliştirilmiştir. Geliştirilen bu yöntem, biyotiyollerin, çözelti içinde mavi-yeşil olan ve maksimum 734 nm'de absorbansa sahip, ABTS radikal katyonunu renksizleştirme yeteneğine dayanır. Optimum deney koşulları (pH, sıcaklık, zaman) Box-Behnken tasarımı kullanılarak belirlenmiştir. Optimum şartlar pH 8, sıcaklık 600C ve zaman 60 dk olarak elde edilmiştir. Geliştirilen modifiye ABTS-Persülfat yöntemi ve modifiye Ellman yöntemi kullanılarak indirgenmiş glutatyon, yükseltgenmiş glutatyon, N-asetil sistein, sistein, sistin, homosistein, homosistin ve sisteamin gibi biyotiyol bileşiklerin tayini yapılmıştır. Her bir biyotiyol bileşiği için molar absorplama katsayıları, lineer çalışma aralıkları belirlenmiştir. Geliştirilen yöntem, sentetik serum örneklerine uygulanarak kesinlik, doğruluk parametreleri test edilmiştir. Geliştirilen modifiye ABTS-Persülfat yönteminde biyotiyollerin gözlenebilme sınırları (LOD) 1.30x10-7 M ile 8.25x10-7 M arasında bulunmuştur. Referans yöntem olarak kullanılan modifiye Ellman yönteminde ise 9.33x10-7 M ve 1.55x10-5 M arasında bulunmuştur. Geliştirilen modifiye ABTS-Persülfat yöntemi ve modifiye Ellman yöntemi için, ikili, üçlü ve dörtlü sentetik karışımlar hazırlanarak N-asetil sistein eşdeğeri cinsinden teorik ve deneysel tiyol içerikleri değerlendirilmiştir. Geliştirilen modifiye ABTS-Persülfat yöntemi kullanılarak polifenolik bileşikler varlığında biyotiyollerin tayini yapılmış ve bulgular HPLC yöntemi ile karşılaştırılmıştır. Geliştirilen modifiye ABTS yöntemi ile ilaç örneklerindeki tiyol içerikleri belirlenmiş ve bulgular modifiye Ellman ve HPLC yöntemi ile karşılaştırılmıştır.

Biothiols play an important role in the physiological and biochemical processes in human body. Abnormal changes in cellular thiol level are associated with many diseases, including Alzheimer's, diabetes, HIV, cardiovascular diseases and cancer. Therefore, the development of methods that can quantitatively determine of biothiols is extremely important to prevent the occurrence of diseases. In this thesis work, a modified ABTS-Persulfate method was developed for spectrophotometric determination of biothiols. The developed method is based upon the ability of biothiols to decolorize the ABTS radical cation (ABTS•+), which is blue-green in solution and has an absorbance maximum of 734 nm. Optimum experimental conditions (pH, temperature, time) were determined by using Box-Behnken design. Optimum condition was obtained at pH 8, temperature 600C and time 60 minutes. Biothiol compounds such as reduced glutathione, oxidized glutathione, N-acetyl cysteine, cysteine, cystine,homocysteine, homocystine and cysteamine were determined by using a developed modified ABTS-Persulfate method and modified Ellman assay. Molar absorption coefficients and linear concentration range were determined for each biothiol compounds. The precision, accuracy and linearity parameters of the developed method were tested by applying sentetic serum. In the developed modified ABTS-Persulfate method, limit of detection (LOD) values of biothiols were found in the range of 1.30x10-7 M ile 8.25x10-7 M. Limit of detection (LOD) values of biothiols were found in the range of 9.33x10-7 M ve 1.55x10-5 M in modified Ellman assay. The developed modified ABTS-Persulfate method and modified Ellman assay was applied to the binary, ternary, quaternary synthetic mixtures and the theoretical and experimental NAC equivalent thiol content values were evaluated. Biothiols were determined in the presence of polyphenolic compounds by using a developed modified ABTS-Persulfate method and the findings were compared with those of HPLC assay. The thiol content in pharmaceutical samples was determined by a developed modified ABTS method and findings were compared with those of modified Ellman assay and HPLC assay.