Biyotiyollerin tayini için altın nanoparçacık esaslı florometrik yöntem geliştirilmesi

Abstract

Düşük molekül ağırlıklı endojen biyotiyoller (sistein, N-asetil sistein, homosistein, indirgenmiş ve yükseltgenmiş glutatyon vb.) insan vücudunda birçok fizyolojik ve patolojik proseslerde merkezi rol oynamaktadır. Hücresel tiyollerin seviyesi kanser, Alzheimer ve kardiyovasküler hastalıklar gibi birçok hastalık ile bağlantılıdır. Bu nedenle, kompleks matrislerde biyotiyollerin belirlenmesi ve kantitatif tayini oldukça önemlidir. Bu tez çalışmasında, biyotiyollerin hassas tayini için nanoparçacıkların yığın halindeki malzemelerden daha üstün ve sıradışı özelliklerinden yararlanılarak altın nanoparçacık (Au-NP) esaslı sensör geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu sensör, sitrat-stabilize altın nanoparçacıkların yüzeyine suda çözünen florofor Rodamin-6G (Rd6G) boyar maddesinin kovalent olmayan etkileşimle adsorbe olması sonucu floresansta bir sönüm gerçekleşmesi ve biyotiyollerin Au-NP'ların yüzeyine gösterdikleri yüksek afiniteleri sebebiyle açığa çıkan Rd6G moleküllerinin floresansının 552 nm emisyon dalgaboyunda ölçülmesi esasına dayanmaktadır.Önerilen florometrik sensör ile sistein, sistin, indirgenmiş ve yükseltgenmiş glutatyon, homosistein, homosistin, sisteamin, metiyonin, lipoik asit, 1,4-ditiyoeritritol ve penisilamin gibi biyotiyol bileşiklerin standart çözeltilerinin emisyon spektrumları elde edilmiştir. Her bir biyotiyol için kalibrasyon eğrileri oluşturulmuş ve bu bileşiklerin floresans katsayıları ile lineer konsantrasyon aralıkları belirlenmiştir. Geliştirilen sensör, doku homojenatlarına uygulanarak kesinlik, doğruluk, lineerlik parametreleri test edilmiş ve yöntem valide edilmiştir. Biyotiyollerin gözlenebilme sınırları (LOD) 0.11 µM ile 1.06 µM arasında bulunmuştur. Üçlü sentetik karışımlar hazırlanarak teorik ve deneysel sistein eşdeğeri tiyol içerikleri kıyaslanmıştır. Florometrik Rd6G/Au-NP yöntemi kullanılarak elde edilen biyotiyollerin sistein eşdeğeri tiyol içeriği (SETİ) değerleri, DTNB (5,5'-ditiyobis-(2-nitrobenzoik asit)) reaktifinin kullanıldığı orjinal Ellman yöntemiyle elde edilen değerlerle karşılaştırılmıştır. İki yöntem bulgularının birbiriyle uyumlu olduğu ve anlamlı bir fark olmadığı gözlenmiştir (p<0.05). Ellman yöntemi sadece sülfidril (-SH) grubu biyotiyollere cevap verirken, geliştirilen sensör hem sülfidril hem de disülfür (S-S) grubu biyotiyollere cevap vermektedir. Çeşitli girişim yapıcı bileşiklerin (polifenoller, plazma antioksidanları vb.) reaksiyon ortamını bozucu etkileri incelenmiştir. Florometrik Rd6G/Au-NP sensörü bazı farmasötik ilaç örneklerine başarıyla uygulanarak tiyol içerikleri belirlenmiş ve bulgular HPLC yöntemi ile karşılaştırılmıştır.

Endogenous low molecular weight biothiols (cysteine, N-acetylcysteine, homocysteine, reduced and oxidized glutathione etc.) play a central role in a variety of physiological and pathological processes in the human body. The levels of certain cellular thiols have been linked to a number of diseases, including cancer, Alzheimer's, and cardiovascular disease. Therefore, detection and quantification of biothiols in complex matrices is very important. In this thesis study, it was aimed to develop gold nanoparticle (Au-NP) based sensor utilizing superior and extraordinary properties of nanoparticlescompared to that of bulk materials for the sensitive determination of biothiols. This sensor is based on the adsorption of water-soluble fluorophore Rhodamin-6G (Rd6G) dye to the surface of citrate-stabilized gold nanoparticles by non-covalent interaction resulting in a quenching of fluorescence and measurement of fluorescence increment at 552 nm emission wavelength as a result of the release of Rd6G molecules from the nanoparticle surface in the presence of biothiols due to their high surface affinities. Emission spectra of biothiol standard solutions such as cysteine, cystine, reduced and oxidized glutathione, homocysteine, homocystine, cysteamine, methionine, lipoic acid, 1,4-Dithioerythritol and penicillamine were obtained by using the proposed fluorometric sensor. Calibration curves were generated for each biothiol and the linear concentration ranges were determined by the molar fluorescence coefficient of these compounds. The precision, accuracy and linearity parameters of the developed sensor were tested by applying tissue homogenates and the method was validated. Limit of detection (LOD) values of biothiols ranged between 0.11 μM and 1.06 μM. The experimental and theoretical cysteine equivalent thiol content (CETC) values of ternary synthetic mixtures were evaluated. CETC values obtained by using fluorometric Rd6G/AuNP method of biothiolswere compared with the original Ellmanassay using DTNB (5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)) reagent. It was observed that the findings of two assays were in accordance with each other and had no significant difference (p<0.05). While Ellman assay merely responds to sulphydryl (-SH) group, the developed sensor responds to biothiols that have both sulphydryl and disulphide (S-S) groups. The effects of various interferent compounds (polyphenols, plasma antioxidants, etc.) were evaluated. Fluorometric Rd6G/AuNP sensor was successfully applied to some pharmaceutical samples, their thiol contents were determined and the findings were compared with those of HPLC assay.