Koyun in vitro embriyo üretiminde aktivin a etkisi ve moleküler cevabın karakterizasyonu

Abstract

Çalışmada, koyunlarda in vitro ortamda şekillenen morula ve blastosist verimlerinin geliştirilmesi amacı ile farklı gelişim evrelerinde uygulanan farklı miktarlarda (10 ng/ml, 50 ng/ml ve 100 ng/ml) aktivin A proteini içeren medyumlarda oosit ve embriyoların gelişimleri değerlendirildi. Ayrıca blastosistlerde büyüme ve apoptoz faktörlerinin bağıl miktarları incelenerek Bmp4, Smad4, Bax, Blc-2 ve Caspase-3 gen transkriptlerinin değişim oranları karşılaştırılmıştır. Bu amaçla mezbahadan alınan koyun ovaryumlarından 1237 adet oosit kullanılarak metafaz I (MI), metafaz II (MII), bölünen, morula öncesi, morula sonrası, blastosist ve dejenere hücre sayıları değerlendirilmiştir. Farklı zaman aralıklarında aktivin A'nın etkilerinin incelenmesi amacıyla iki deney planı oluşturulmuştur. Deney planı A'da 10, 50 ve 100 ng/ml aktivin A konsantrasyonları maturasyon aşamasında (IVM) kullanılarak; deney planı B'de ise aynı konsantrasyonlar IVF sonrası medyumlara eklenerek aktivin A'nın etkileri incelenmiştir. Aktivin A'nın bölünme oranları üzerine olan en etkili sonucu IVF sonrası ortama 50 ng/ml konsantrasyonunda eklenmesi ile %92,7 verim elde edilmiştir. Maturasyon ortamına eklendiğinde morula gelişiminde sadece 100 ng/ml konsantrasyonda bir artışa neden olduğu (%81,1) ancak IVF sonrası bütün konsantrasyonlarda artışa neden olduğu ve maksimum düzeye (%89,3 morula) 50 ng/ml konsantrasyonu ile ulaştığı görülmüştür. Yine deney planı A'da blastosist yüzdelerinde önemli derecede (p<0,05) azalma meydana gelerek olumsuz bir etki gözlenmiş ancak bu etki IVF sonrası uygulanan deney planı B'de gözlenmemiştir. Aktivin A'nın blastosistlerdeki çeşitli gen ekspresyonlarında her iki deney grubuna da olan etkisi incelendiğinde büyüme ve apoptoz faktörleri üzerinde artma ve azalma gözlenmesine rağmen bu etki %95 güven aralığında anlamlı bir değişimle sonuçlanmamıştır. Bu çalışmada aktivin A proteinin in vitro medyumlara eklenmesinde zamanlamanın önemi ortaya çıkmış ve kullanılan konsantrasyonların embriyonik gelişimde etkili rol oynadığı kanısına varılmıştır.

In present thesis work, effects of activin A at different concentrations (10, 50 and 100 ng/ml) and different developmental stages were evaluated through developmental competence of sheep oocyte and blastocyst to increase rate of morula and blastocyst formation in vitro. Relative mRNA abundance of growth and apoptosis factors were also examined by comparing changes in Bmp4, Smad4, Bax, Blc-2 and Caspase-3 transcripts.1237 oocytes were collected from ovaries of slaughtered sheep females to evaluate metaphase I (MI), metaphase II (MII), cleavage, morula, blastocyst and degenerate cells. Two experimental strategy were conducted to investigate effects of activin A in different time periods. In experiment-A, activin A were used in medium during in vitro maturation (IVM) to examine its effects. Same concentrations were applied after IVF in experiment-B. The highest cleavage rate was obtained with 50 ng/ml as 92.7% in experiment-A. Increase in developmental rate (81.1%) of morula was only seen at 100 ng/ml concentration in experiment-A, but all the concentrations lead to increase in morula rate and reached maximum level (89.3%) at 50 ng/ml in experiment-B. Although blastocyst rates showed significant decrease at 95% interval in experiment-B, any adverse effect was not obtained from experiment-B.Increases and decreases in relative abundance of gene expression levels were observed with addition of activin A. However, there were no significant alterations of growth and apoptosis specific transcripts in either experimental strategy. In conclusion, importance of timing of activin addition to in vitro medium was illustrated and it was suggested that applied concentrations of activin A had efficient role on embryonic development.