Gıda kaynaklı patojenlerin kontaminasyon miktarlarını eş zamanlı PCR teknolojisi ile belirleyecek tanı kitlerinin oluşturulması ve uygulanması

Abstract

Gıda patojenleri tüm dünyada hastalıklara, ekonomik kayıplara ve ölümlere neden olan önemli bir sorundur. Olumsuz etkilere yol açan gıda kaynaklı hastalıkların önlenebilmesi için hastalık etmeni mikroorganizmaların doğru teşhis edilmesi ve kontaminasyon miktarlarının bilinmesi gerekmektedir. Konvansiyonel PCR metodu patojenlerinin tanısında yaygın kullanılmakta ancak uzun zaman alması ve miktar ile ilgili sınırlı bilgi vermesinden dolayı Real Time PCR teknolojisi ile desteklenmektedir. Real Time PCR metodu kantitatif hassasiyeti, düşük belirleme limiti, spesifikliği ve hızı gibi avantajlarından dolayı gıda patojenlerini tanımlamada kullanılan güvenilir bir yöntemdir.Tez çalışmasında, farklı mikrobiyal gıda patojenlerinin tanımlaması için ortologus (16S rRNA) gen bölgesi amplifikasyonu yapılmış ve tanımlamalar nükleotid dizileme ile teyit edilmiştir. Tür seviyesinde tanımlanmış patojen mikroorganizmalar gıdalarda birlikte bulunabilirlik özelliklerine göre gruplandırılarak dört farklı multipleks PCR reaksiyonu oluşturulmuş ve standardizasyonu yapılmıştır. Standardize edilen dört reaksiyon ile dokuz farklı patojenin multipleks tanımlaması başarı ile yapılmıştır. Real Time PCR amplifikasyonu ile referans mikroorganizmaları bireysel olarak amplifiye edecek metotlar standardize edilmiş ve DNA konsantrasyonu ile koloni sayıları arasındaki korelasyonlar ile DNA-koloni ilişkileri belirlenmiştir. Türe spesifik reaksiyonlar birleştirilerek dört farklı Real Time PCR reaksiyonu tanımlanmıştır. Bu multipleks reaksiyonlar ile dokuz patojenin popülasyondaki miktarlarını belirleyecek kitler başarı ile oluşturulmuştur. Tez kapsamında geliştirilen Konvansiyonel ve Real Time PCR kitleri ile toplanan et, süt ve su örneklerinde uygulanabilirliği çalışmaları yapılarak bu gıda ürünlerinde patojen kontaminasyon varlıkları ve mikrobiyal yük tasarladığımız moleküler kitler ile tespit edilmiştir. Geliştirilen Real Time PCR kitleri gıda numunelerinde toplam patojen varlığının ve dinamiğinin belirlenmesine alternatif metotlar sunmaktadır.

Food-borne pathogens are an important problem which causes financial detriments, illnesses and deaths all over the world. In order to prevent the food-borne diseases and their adverse effects,it is necessary to identify the casual agents and to quantify their contamination accurately. Conventional PCR method is widely used in identification of pathogens; however, this method needs to be confirmed by Real Time PCR due to the fact that conventional approach is time consuming and the information it provides about the quantity of the pathogen is insufficient. Real Time PCR is a reliable technique used in the diagnosis of food pathogens since it has the advantages of speed, specificity, sensitive quantification, low detection limit, and a dynamic wide-range.In this thesis, different food pathogens were identified using orthologous genes region (16S rRNA) and the identifications were confirmed with nucleotide sequencing. Four different multiplex PCR reactions were designed and standardized by separating the pathogen microorganisms identified at the species level into various groups depending on their ability to coexist in food samples. The multiplex identification of nine pathogens was successfully accomplished through four standardized multiplex reactions. The methods to individually amplify the reference microorganisms through RealTime PCR were standardized and the correlations between DNA concentration and colony numbers were determined, along with the DNA-colony relationships. Four different Real Time PCR protocols were constituted through the combination of species specific reactions. By virtue of these multiplex reactions, kits to determine the percentage of nine pathogens in a given population were efficiently generated. In the scope of this thesis, not only were the conventional and Real Time PCR kits developed tested on collected meat, milk and water samples, but also their feasibility at determining the presence of the contaminants and their amounts in these samples were demonstrated. Newly-developed Real Time PCR kits offer an alternative method to ascertain the existence of pathogens and their dynamics in food samples.