FSH promotes progesterone synthesis and output in human granulosa cells without luteinization

Abstract

Günümüz üremeye yardımcı tedavi (ÜYTE) uygulamalarında hipofiz bezini baskılamak için kullanılan GnRH analogları prematür LH piki görülme sıklığını IVF sikluslarında %2'nin altına düşürmüştür. Bununla birlikte, geç foliküler fazda LH piki öncesi serum progesteron seviyelerinde artış görülme sıklığı GnRH agonist ile stimüle edilen IVF sikluslarında %35'i ve GnRH antagonist ile stimüle edilen sikluslarda da %38'i bulmaktadır.Serum progesteron düzeylerinde ovülasyon öncesi görülen prematür artış IVF sikluslarında endometriyal histolojiyi ve endometriyal gen ekspresyonlarını değiştirerek reseptiviteyi azaltabilmektedir. Bunun sonucunda da taze embryo transferlerinde düşük implantasyon ve klinik gebelik oranlarıyla karşılaşılmaktadır.Prematür progesteron yükselmesinin doğal sikluslara oranla stimüle sikluslarda görülmesi ve stimülasyonun derecesiyle kuvvetli korelasyon göstermesi bu prematür yükselmeden FSH stimülasyonun direkt olarak sorumlu olduğunu düşündürmektedir (hCG günü estradiol düzeyi, antral folükül sayısı ≥ 14mm ve elde edilen oosit sayısı). Bu hipotezi araştırmak amacıyla düzenlenen deneysel dizaynda cevap aranılan sorular şunlardır: 1) FSH uygulaması granüloza hücrelerinde progesteron üretimini 3β-HSD geninin ekspresyonunu yükselterek mi stimüle etmektedir? 2) FSH uygulaması ile ovaryan seks steroidogenez enzimlerinin ekspresyonlarında görülen yükselme korelasyon göstermekte midir?Bu amaçla lüteinze olmayan mitotik granüloza hücreleri ve over kortikal örnekleri DMEM-F12 kültür medyumu kullanılarak mililitre başına 12.5, 25 ve 50 mIU olmak üzere üç farklı FSH dozu ile farklı zaman aralıklarında inkübe edilmiştir. İnkübasyon periyotları sonunda steroidogenik enzimlerde FSH'a bağlı meydana gelen değişimler mRNA düzeyinde qRT-PCR ile ve protein düzeyinde western blot ile incelenmiştir. In vitro E2 ve Progesteron düzeylerini elektrokemiluminesans (ECLIA) methoduyla ölçülmüştür. Son olarak da 3β-HSD'nin protein ekspresyonunun yanı sıra işlevini de gösterebilmek için spektrofotometrik method ile enzimatik aktivitesine bakılmıştır.Bu tez, gonadotropin stimülasyonu uygulanan sikluslarda foliküler faz sırasında açıklanamayan P yükselmesine moleküler bir açıklama sağlamaktadır. Sunulan bulgular, IVF tedavisi gören kadınlarda prematür P artışını önlemeye yönelik potansiyel mekanizmaları ortaya çıkartmak için yapılacak çalışmalara örnek oluşturabilir.

In the modern era of assisted reproductive technologies, pituitary suppression with gonadotropin releasing hormone (GnRH) analogues has drastically reduced the incidence of premature luteinizing hormone (LH) surge to less than 2% per stimulated in vitro fertilization (IVF) cycle. Nevertheless, subtle elevations in serum progesterone (P) level during late follicular phase may still occur without LH surge in up to 35% and 38% of the stimulated IVF cycles with GnRH agonist and antagonist protocols, respectively. The premature rise in serum P before ovulation trigger may reduce the success of pregnancy in stimulated IVF cycles by advancing endometrial histology and impairing endometrial receptivity when fresh embryo transfer (ET) is performed. It is well-documented that serum P level at the time of human chorionic gonadotropin (hCG) administration is significantly correlated with the magnitude of ovarian response to stimulation (antral follicle count ≥ 14mm, estradiol level at the time of hCG administration and the number of eggs retrieved). Even though the underlying mechanism of this event is obscure its almost exclusive occurrence in stimulated but not in natural IVF cycles raises a fundamental question as to whether FSH stimulation itself might be responsible for P output from granulosa cells without luteinization. To address this issue we designed an experimental study and investigated 1) whether FSH stimulates granulosa cell progesterone output by upregulating the expression of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD); the enzyme that converts pregnenolone to progesterone, and 2) whether FSH induces proportional increases in the expression of ovarian steroidogenic enzymes (StAR, SCC, 3β-HSD, 17α-OH, 17β-HSD and aromatase). To this end, non-luteinizing, mitotic and FSH-responsive human granulosa cells (HGrC1) and human ovarian tissue samples were stimulated with recombinant FSH at different concentrations and time points. To mimic the ovarian micro-environment in the ovary in stimulated IVF cycles, FSH was used at concentrations corresponding to its endogenous levels in the sera of IVF patients undergoing ovarian stimulation with rec-FSH. FSH induced changes in the enzymatic activity of 3β-HSD were measured, and the expression of the ovarian steroidogenic enzymes were analyzed by quantitative real-time PCR and western blot. FSH responsiveness of these enzymes was further investigated after FSH receptor was up-regulated with activin-A, and down-regulated with shRNA technology. This thesis provides a molecular explanation for the largely unexplained phenomenon of P rise during the follicular phase of gonadotropin stimulated IVF cycles prior luteinization. Presented findings may pave the research to uncover potential mechanisms for preventing premature P rise that appears to be associated with inferior outcomes in women undergoing IVF.