Understanding of tumor heterogeneity in glioblastoma multiforme cell lines with differential apoptotic threshold

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM), tanı sonrası yaşam süresi çok kısa olan en yaygın ve agresif primer beyin tümörüdür. Güncel tedavi yaklaşımları, tümörün cerrahi olarak rezeksiyonunu takiben radyo ve kemoterapiyi içerir. Tümör Nekroz Faktörü ile İlişkili Apoptoz-İndükleyici Ligand (TRAIL), özellikle tümör hücrelerinde apoptozu indüklediği için kanserde önemli bir terapötik adaydır. Bununla birlikte, GBM de dahil olmak üzere birçok tümör hücresi, ya TRAIL'a baştan dirençlidir ya da henüz yeterince anlaşılamamış sonradan gelişen mekanizmalarla direnç kazanır. Bu tez çalışmasında, TRAIL direncindeki moleküler değişiklikleri değerlendirmek için farklı GBM hücre dizileri kullanarak TRAIL-dirençli hücre modelleri geliştirilmiştir. TRAIL'a dirençli hücreler kronik ve uzun süreli TRAIL'a maruz kalma yoluyla seçilmiş, bu hücrelerin direncinin kalıcı olduğu in vitro ve in vivo çalışmalarla gösterilmiştir. Tüm hücre modellerinde TRAIL direncini kırabildiği bilinen TRAIL-duyarlılaştırıcılarından HDAC inhibitörü MS-275 değil, proteazom inhibitörü Bortezomib etkili olmuştur. Bu durum, ölüm reseptörleri, pro-apoptotik proteinler ve majör anti-apoptotik proteinler olan Bcl-2 ve Bcl-xL'nin ekspresyonunun düzenlenmesiyle sağlanmıştır. Ayrıca, CRISPR/Cas9 aracılı DR5 susturulmasının Bortezomib aracılı hassaslaştırmayı engelleyebileceği gösterilmiştir. Bcl-2 veya Bcl-xL'nin yüksek ifadesinin, TRAIL'a duyarlı hücrelere direnç kazandırmak için yeterli olduğu, fakat Bortezomib aracılı yeniden hassaslaştırmayı engelleyemediği bulunmuştur. TRAIL'e duyarlı ve dirençli hücrelerde yaptığımız RNA dizilimi ile özellikle NF-kB yolu gibi inflamasyon sinyallerinde büyük değişiklikler tespit edilmiştir. NF-kB'nin QNZ ile engellenmesi, Bortezomib'den daha düşük olsa da TRAIL'a dirençli hücreleri büyük ölçüde hassaslaştırmıştır. Sonuç olarak, çalışmamız GBM tümörleri içindeki heterojen terapi yanıtları hakkında daha fazla bilgi edinmek için gerekli araçları sağlayacak olan yeni kazanılmış TRAIL-direnci modellerini sunmaktadır. Ek olarak, bu bulgular kazanılmış direncin üstesinden gelmek için proteazom inhibitörlerinin ve pro-apoptotik ligandların birleştirilmesinin kritik önemini vurgulamaktadır.

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and aggressive primary brain tumor, with very low survival rate after diagnosis. Current treatment approaches include radio and chemotherapy following resection of tumor by surgery. Tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) induces apoptosis specifically in tumor cells, making it a prime therapeutic candidate. However, many tumor cells, including GBM, are either innately TRAIL-resistant, or they acquire resistance with adaptive mechanisms that remain poorly understood. In this thesis, we generated acquired TRAIL resistance models using multiple GBM cell lines to assess the molecular alterations in the TRAIL-resistant state. We selected TRAIL-resistant cells through chronic and long-term TRAIL exposure and showed that these cells showed persistent resistance in vitro and in vivo. Among known TRAIL-sensitizers, proteasome inhibitor Bortezomib, but not HDAC inhibitor MS-275, was effective in overcoming resistance in all cell models. This was partly achieved through upregulating death receptors and pro-apoptotic proteins, and downregulating major anti-apoptotic members, Bcl-2 and Bcl-xL. We showed that CRISPR/Cas9 mediated silencing of DR5 could block Bortezomib-mediated re-sensitization, demonstrating its critical requirement. While overexpression of Bcl-2 or Bcl-xL was sufficient to confer resistance to TRAIL-sensitive cells, it failed to override Bortezomib-mediated re-sensitization. With RNA sequencing in multiple paired TRAIL-sensitive and TRAIL-resistant cells, we identified major alterations in the inflammatory signaling, particularly in the NF-kB pathway. Inhibiting NF-kB with QNZ substantially sensitized the most resistant cells to TRAIL, albeit its sensitization ability was lower than that of Bortezomib. Together, our findings provide new models of acquired TRAIL resistance, which will provide essential tools to gain further insight into the heterogeneous therapy responses within GBM tumors. Additionally, these findings emphasize the critical importance of combining proteasome inhibitors and pro-apoptotic ligands to overcome acquired resistance.