New therapy approach against E. coli ST131 infection: Nanoparticle based targeted antimicrobial agents

Abstract

Escherichia coli (E.coli) ST131 çok ilaca dirençli ve yüksek riskli bir klon olup antibiyotik tedavisine yanıtı kısıtlıdır. E.coli ST131 enfeksiyonlarının tedavisinde antibiyotiklerin etkisiz olması nedeniyle yeni tedavi yaklaşımlarına ihtiyaç vardır. Bu çalışmada amacımız, E.coli ST131 klonunu hedefleyen SPION (Süper Paramanyetik Demir Oksit Nanoparçacık) destekli bir antimikrobiyal ilaç taşıma sistemi tasarlanmasıdır.SPION destekli kargo sisteminin aktivitesi kinolon dirençli üropatojenik E.coli ST131 izolatı üzerinde incelenmiştir. Polimer ve Nanoparçacık Araştırma Laboratuvarında sentezlenen Poliakrilik asit (PAA) kaplamalı SPION parçacıklar, FeCl2 ve FeCl3 tuzlarının oksijeni uzaklaştırılmış suda çözülerek sentezlenmiş ve karakterizasyonu yapılmıştır. Parçacık boyu 33.2 nm olarak ayarlanmıştır. Karakterizasyon esnasında parçacığın kristal büyüklüğü, yüzey yük dağılımı ve kararlılığı ölçülmüştür. Daha sonra SPION'ların E.coli ST131 FimH adhesin molekülünü hedeflemesi için, parçacıklar mannozid analoğu olan 4-aminofenil α-D-mannopiranozid ile bağlanmıştır. Hedefe yönelik ilaç salınımı modelininin tasarımı için SPION parçacığa mannozid konjugasyonunun ardından siprofloksasin eklenmiştir. Sentezlenen parçacıkların E.coli ST131 hücre duvarına spesifik bağlanmaları ve antibakteriyel etkinlikleri, planktonik hücreler ve biyofilm üzerindeki üremeyi inhibe edici etkileri, konfokal mikroskobisi ve elektron mikroskobu (SEM) ile morfolojileri çalışılarak araştırılmıştır. Sonraki aşamada SPION inkübasyonuna ek olarak planktonik hücreler ve biyofilmlere 1150 mW güç ile on dakika boyunca fototermal terapi (FTT) uygulanmıştır.SPION parçacıklar 25 μg/ml konsantrasyonda (tek veya mannozid ile konjuge) E.coli ST131 planktonik ve biyofilm hücrelerinde üremeyi inhibe etmemiştir. SPION ve SPION-Mannozid için ortalama koloni sayıları planktonik hücrelerde sırasıyla 2.26x1012 ve 9.89x1011 KOB/ml olarak bulunmuş, kontrol kültüründe 1.22x1012 KOB/ml üreme olmuştur. Biyofilmde ise 25 μg/ml mannozidle konjuge SPION ile ortalama 1.55x1010 KOB/ml üreme olmuş, tek başına SPION ve kontrol kültürlerinde sırasıyla 2.04x1010 KOB/ml ve 7.76x109 KOB/ml üreme saptanmıştır. Konfokal mikroskop analizinde mannozid konjuge parçacıklar tek başına SPION parçacığa kıyasla E.coli ST131 bakteri yüzeyiyle daha spesifik ve daha kuvvetli bir etkileşim göstermiştir. Biyofilmde ise parçacıklar biyofilm yüzeyinde dağınık olarak izlenmiş ve parçacıkların biyofilm matriksine penetrasyonu bulunmamıştır.Mannozidle konjuge SPION parçacığa siprofloksasin eklenmesi ile planktonik ve sesil hücrelerin üremesinde anlamlı bir inhibisyon bulunmamıştır (ortalama KOB/ml değerlerinde 2-log ve üzeri azalma). Planktonik hücrelerde ortalama koloni sayısı siprofloksasin eklenmiş SPION-Mannozid parçacıkta ve kontrol kültüründe sırasıyla 1.70x1010 ve 4.32x1012 KOB/ml olarak bulunmuştur. Biyofilmde siprofloksasin ekli parçacık ile inkübasyon sonrası ortalama koloni sayısı 1.66x1010 KOB/ml iken kontrol kültüründe bu değer 3.24x1010 KOB/ml olarak saptanmıştır. FTT uygulaması kargo sisteminin etkinliği üzerinde bir etki göstermemiş ve lazer ışını maruziyeti bakteri üremesinde inhibisyona neden olmamıştır.SPION destekli hedefe yönelik tedavi, E.coli ST131 klonuna bağlı enfeksiyonların tedavisi için özgün ve umut vaat eden bir yöntemdir. Bu çalışma kapsamında ileriye yönelik hedeflerimiz, mannozid konjuge SPION kargo sistemine kinolon türevi moleküllerin ve efluks pompa inhibitörlerinin entegre edilmesi olarak belirlenmiştir.

Escherichia coli (E.coli) ST131 is a globally disseminating high risk clone associated with multidrug resistance and failure of antimicrobial therapy. There is an urgent need for alternative approaches to treat E.coli ST131 infections. Our aim was to design a SPION (Super Paramagnetic Iron Oxide Nanoparticle) based drug delivery system targeting E.coli ST131 clone.In this study, we studied on a quinolone resistant uropathogenic E.coli ST131 isolate to assess the efficacy of targeted delivery system. Polyacrylic acid (PAA) coated SPIONs were synthesized by dissolving FeCl2 and FeCl3 salts in deoxygenated water and coating SPIONs with PAA. Nanoparticle size was 33.2 nm. After characterization of the particles regarding hydrodynamic and crystal size, zeta potential for surface charge and stability, SPIONs were conjugated with mannoside analog (4-aminophenyl α-D-mannopyranoside) to target fimH adhesin of E.coli ST131. Subsequently, ciprofloxacin was attached to the SPION-Mannoside complex. Specific interaction and antibacterial activity of delivery system were examined on planktonic and sessile cells of E.coli ST131 isolate by using growth inhibition, confocal imaging, and scanning electron microscopy (SEM) techniques. Furthermore, photothermal therapy (PTT) was applied at power of 1150 mW for ten minutes in combination with SPION exposure.SPIONs at 25 μg/ml concentration (alone or conjugated with mannoside) did not cause significant growth inhibition both on planktonic and sessile cells of E.coli ST131. The mean colony count of E.coli ST131 planktonic cells after incubation with SPION and SPION-Mannoside were 2.26x1012 and 9.89x1011 CFU/ml, respectively while it was 1.22x1012 CFU/ml in control culture. In biofilm, incubation with mannoside conjugated 25 μg/ml SPION resulted in 1.55x1010 CFU/ml mean colony count while SPION and control cultures revealed 2.04x1010 CFU/ml and 7.76x109 CFU/ml bacterial growth, respectively. Confocal microscopy indicated more specific and enhanced attachment of SPION-Mannoside particles to the surface of E.coli ST131 compared to SPION alone. However, the SPION particles were seen accumulated on biofilm surface and did not penetrate inside the biofilm matrix.After conjugation of ciprofloxacin to SPION-mannoside, the delivery system did not cause a significant reduction in growth of planktonic and sessile cells (log change in mean CFU/ml lower than 2-log). The mean colony counts of planktonic cells were 1.70x1010 and 4.32x1012 CFU/ml at ciprofloxacin-mannoside conjugated SPION and control cultures, respectively. In biofilm, incubation with ciprofloxacin-mannoside conjugated SPION resulted in growth of 1.66x1010 CFU/ml mean colony count while it was 3.24x1010 CFU/ml for control. PTT application did not enhance the efficiency of delivery system. No significant decrease in bacterial growth was observed.SPION based targeted therapy is a unique and promising approach to treat persistent E.coli ST131 infections. Our future goals are to integrate quinolone derivatives and efflux pump inhibitors to our mannoside conjugated SPION cargo system.