Ökaryot elongasyon faktörü 2 (EF-2) üzerinde çalışmalar

Abstract

89 V. ÖZET Sıçan karaciğeri elongasyon faktörü 2*nin guanin nükleo- t itler ve ribozom ile etkileşimi ODP-agaroz afin it e kromatografisi yöntemi ile araştırıldı. EF-2'nin ODP'ye gösterdiği yüksek ilgiden yararlanan bu yöntemle, faktörün etkin bir biçimde saflaştırılması da sağlandı. ODP-agaroz'a bağlanan EF-2'nin, 1 uM'ın üzerinde ODP içeren tamponla, özgün biçimde ODP-agaroz. dan yıkanabildiği, ayrıca 0. 2 uM ribozom varlığında da EF-2'nin GDP-agaroz'dan ayrış masının mümkün olduğu gözlendi. Bu bulgular EF-2. ODP ikili komplek sinden EF- 2.0TP. ribozom üçlü kompleksine dönüşümün, EF-2. ribozom ara aşaması yoluyla gerçekleşebileceğini sezindirdi. EF-2'nin oksitlenmiş guanin nükleotitlerle etkileşimi de nitroselüloz filtre yöntemiyle araştırıldı. QTP, ve ODP, 'un * oks oks EF-2 ile kalımlı ve stokiyometrik oranlarda etkileştiği ve-bu kalımlı komplekslerin uzun süreli diyaliz ya da ortama eklenen ser best OTP varlığında da çözünmediği görüldü. Ayrıca QTP ve ODP ile etkileşmiş EF-2'nin, ribozom varlığında OTP bağlayabil diği de gözlendi. OTP ya da ODP ile etkileşmiş EF-2'nin ribozom varlığında OTP bağlamasının, poli-Phe sentezi etkinliğinin değişmediği, OTPaz etkinliğinin ise çok az bir oranda azaldığı görüldü. OTP 'un, EF-2'nin ribozoma bağımlı OTPaz etkinliğinde substrat olarak kullanılabildiği, OTPaz tepkimesinde OTP için gözlenen K değerinin 3.4 uK'dan OTP. ile ^.^ uM'a yükseldiği bulundu. Buna karşılık, 0uoPP(CH9)P ile etkileşmiş EP-2*nin ribozom varlığında GTP bağlamasının, OTPaz ya da poli-Phe sentezin-90 deki etkinliğinin çok büyük oranda kaybolduğu gözlendi. Diğer yandan, ODP ve ADP'nin poli-Phe ya da OTPaz tepkime sine doğrudan eklenmesiyle gözlenen baskılayıcı etki araştırıl dı. Poli-Phe sentezinde ODP'nin neden olduğu inhibisyonun her iki elongasyon faktörünün artan miktarlarıyla tümüyle geri dönüştürülebildiği, buna karşılık, GTP'nin, yalnızca düşük ODP konsantrasyonlarında gözlenen ihhibisyonu geri dönüştürebildiği, yüksek ODP konsantrasyonlarında ise aynı ölçüde etkili olamadığı gözlendi. OTPaz sisteminde ise, ODP inhibisyonunu artan EF-2 miktarlarının etkileyemediği, OTP'nin ise geri dönüştürebildiği gözlendi. Oksitlenmiş nükleotitlerle et kil eşmiş EF-2'nin, OTPaz sisteminde ODP'nin yol açtığı inhibisyondan bir ölçüde korunduğu görüldüğü halde, poli-Phe sentezinde böyle bir sonuca rastlanmadı, ODP'nin değişik sistemlerde, farklı konsantrasyonlarda, farklı etkilerinin gözlenmesi, ODP'nin yol açtığı inhibisyonların farklı mekanizmaların etkisiyle de oluşabileceğini düşündürdü. EP-2'nin doğrudan ya da ribozom varlığında guanin nükleotitlerin bağlanmasında gösterdiği farklılık ve difosf atlara özgü ikinci bir bağlama bölgesinin varlığını sezindiren bulgular, ET-2'nin nükleotitlerle doğrudan etkileşimde yer alan bu ikinci bağlama bölgesinin KF-2'nin protein sentezi etkinliğinde düzenleyici bir işlevi olabileceğini düşündürdü.

91 VI. SUMMARY Interactions of rat liver elongation factor 2 with guanine nucleotides and ribosomes «ere investigated by GDP-agarose affinity chromatography. Using this affinity methodi a very effective purification of EF-2 was also achieved, based on its high affinity for GDP. Column-bound EF-2 could be specifically eluted by increasing concentra tions of QDP over 1 jiM QDP in the elution buffer. EF-2 could also be eluted from the GDP-agarose column by 0.2 uH ribosomes, implying that ribosomes can recyle EF-2 from EF-2. QDP complex to form the ternary complex via an EF-2.ribo- some intermediate. The interactions of EF-2 with periodate-oxidized guanine nucleotides were also investigated. OTP and QDP were shown ox ox to bind 8tochiometrically to EF-2 and remained on the factor even after extensive dialysis and were not exchangeable with free nucleotides. After addition of CTP in the presence of ribosomes an increment in the amount of total bound guanine nucleotides were observed. However, ribosome-dependently bound GTP exchanged quantitatively with free QTP. The prebinding of GTP or GDP to EF-2 did not affect the subseguent ox ox ^ ribosome-dependent GTP binding and poly-Phe synthesis activity and inhibited only partially the OTPase activity of the factor. GTP was found to be fully active in EF-2 and ribosome dependent GTPase reaction. K values found for GTP and GTP were 7.7 uK o ox ' ' r92 and 3.4 uM respectively. On the other hand, the prebinding of GuoPP(CH )P to EF-2 inhibited very strongly the subsequent ribosome-dependent OTP binding and QTPase reaction as well as poly-Phe synthesis. The inhibitory effects of GDP and ADP by direct addition into poly-Phe synthesis and QTPase reaction were also investigated. GDP-caused inhibition in poly-Phe synthesis »as fully reversible by increasing concentrations of both elongation factors. However, QTP had reversing effects on the inhibition only for lower concentrations of GDP. Interestingly, EF-2 failed to reverse the GDP-caused inhibition in GTPase system, while GTP was fully res ponsible for reversing the inhibition. Preincubation of EP- 2 with oxidized nucleotides have some preventative effects on GDP and ADP-caused inhibition in GTPase reaction, while the same effect could not be observed in poly-Phe synthesis. In view of the different behaviours of different concent rat i on t of GTP on GDP-caused inhibitions in different systems, it was assumed that diphosphate-caused inhibitions on the systems of protein synthesis are governed by different mechanisms. On account of the data, it was possible to assume that the binding site on EF-2 involved in the direct interactions with guanine nucleotides is distinct from that involved in the ternary complex formation and the binding site involved in the direct interactions with guanine nucleotides may play a modulating role on EF-2 activity.