Ökaryot Elongasyon Faktörü 2 (EF-2)`nin etki mekanizmaları

Abstract

V. ÖZEI Çalışmada sıçan karaciğeri elongasyon faktörü 2 (EP-2)1 nin guanin nükleotit `bağlama `bölgesinin yapısının aydınlatıl-- ması için ; gerekli koşullar belirlendibEF-2'ye `affinity labelling` yoluyla bağlanan oksitlenmiş ĞTP» nin (GTPoks' un) serbest GTP ile yavaş bir kinetikle de olsa değişime girdiğinin görülmesi üzer ine, EE-2.GIP.. arasındaki bağın daha kalımlı bir duruma getirilmesine çalışı İdi. HaBH, varlığındaki indirge me işleminin bağın kalımlılığını büyük Ölçüde arttırdığı bulu-. narak ve £^P0vsIuI1 EF-2'ye bir Schiff bazının oluşumu üzerinden bağlandığı sonucuna varı İdi, Kalım İılaştırı İmiş EP-2.GTPolj:s bi- leş iği daha sonra tr ipsinle sindirilerek radyoaktif G-2P0vs'u taşıyan triptik fragment kromatografik işlemlerle saf laştırıl- dı.Dansil klorür işlemiyle saf la ş tın lan peptidin jtfB^-ucundaki amino asidin arginin olduğu belirlendi. Çalışmanın ikinci bölümünde sıçan karaciğer özütünde.EF-2'nin ABP-ribozi İlenmesini sağ lıyan endojen bir transferase, (eADPR-transferaz) etkin Ifğfi saf laştırılarak, tanımlandı. eADPR-. transferâzm, saflaştırma boyunca, EE-2 etkinliğiyle birlikte kaldığı, izoelektrik odaklama iş lemiyle_ homojen ; duduma getiri- * len EP-2 kesiminde de eA3DPR-tna,nsferaz etkinliğinin saflaştır-ma için kullanılan mikrozomüstü sıvı (S-100) kesimim kıyasla 1621 kat -zenginleşmiş olarak bulunduğu saptandı. Homo j en EF-2 proteini natif ya da denatürleyici koşullarda poliakrilamit elektroforez işlemine tutulduğunda eADPR-transferaz etkinliği gene EF-2*ye karşılık gelen protein bandında bulundu. Bu bulgu lardan eADPR-transferaz etkinliğinin EP-2'nin intrinsik bir özelliği olabileceği sonucuna varı İdi.EP-2 * yi özgün bir şekil de inaktif leştiren GuoPP(C5H2)Poks ya da îî-etilmaleyimidin (MEM' in) `eADPR-transferaz etkinliğini de ortadan kaldıntfası bu görüşü destekledi. eADPR-transferaz etkinliğinin reaksiyonda kullanılan NAD* m yaklaşık 500 katı nikotinamit derişimi var lığında ' durduğu ve ADP-ribozi İlenmenin s-100 kesiminin varlığın da geri dönüştüğü gözlendi. Bu bulgular EP-2'nin eADP-ribozil- lenmesinin hücrede düzenlenmesinde rol oynayabilecek mekaniz malar olarak tartışıldı. Çalışmanın son bölümünde ise değişik ortam koşullarının (serumsuz ortam, konfluent durumun yol açtığı kontakt inhibis- yonun ve ısının (42°C) ) hücrelerde eADPR-transferaz etkinli-. ? ğini arttırıcı bir. etkisi olup olmadığı araş tın İdi. Konfluent hücrelerde, b,u etkinliğin az ölçüde artmış olduğu, ayrıca kon- fluent' ve özellikle 42°0'ta tutulmuş hücrelerde, difteri toksi nine bağlı ADP-rîböZ'Öîeteedetki artışın gösterdiği gibi,EP-2 miktarının önemli ölçüde artmış olduğu bulundu. Bu gözlemlerden hareketle EP-2'nin bir `stress` proteini oljnası olasılığı üze'riıide duruldu.

H, SUMMARY In this investigation, conditions required for eluci dating the structure of the guanine nucleotide binding site of rat liver elongation factor 2 (EF-2) have `been determined. After having observed the slow exchange of.oxidized (HOP (GTPoy which was bound* to EP-2 by affinity labelling, with free GTP. studies were Carried out -to render the bond between EE-2 and G2P more stable. She stability of the bond was found to increase, in the presence of NaBIL under reducing conditions and it was concluded that G!I!P _ binds to EP-2 by forming a Schiff base. The stabilized EP-2.G!EPrt_ complex was then digested with trypsin and the tryptic fragment carrying the radioactive ly labelled GQ}P-` was purified by chromato- VjjL graphy.The peptide purified by the dansyl chloride technique was found to contain the amino acid arginine on its ^-terminal. In the second part of this, study, an endogeneous transferase ( eADPR-transf erase) activity which funotions in the ADP-ribosylation of EP-^. rças purified and characterized.from rat liver extraets.lt was observed that the eADPR- */-:'..-*.' transferase and EF-2 activities co-purified. îhe ADPR- transfer- ase activity was found to be enriched 1621 fold in the EF-2 fraction purified to homogenity on isoelectric focusing - *..., *:H, SUMMARY In this investigation, conditions required for eluci dating the structure of the guanine nucleotide binding site of rat liver elongation factor 2 (EF-2) have `been determined. After having observed the slow exchange of.oxidized (HOP (GTPoy which was bound* to EP-2 by affinity labelling, with free GTP. studies were Carried out -to render the bond between EE-2 and G2P more stable. She stability of the bond was found to increase, in the presence of NaBIL under reducing conditions and it was concluded that G!I!P _ binds to EP-2 by forming a Schiff base. The stabilized EP-2.G!EPrt_ complex was then digested with trypsin and the tryptic fragment carrying the radioactive ly labelled GQ}P-` was purified by chromato- VjjL graphy.The peptide purified by the dansyl chloride technique was found to contain the amino acid arginine on its ^-terminal. In the second part of this, study, an endogeneous transferase ( eADPR-transf erase) activity which funotions in the ADP-ribosylation of EP-^. rças purified and characterized.from rat liver extraets.lt was observed that the eADPR- */-:'..-*.' transferase and EF-2 activities co-purified. îhe ADPR- transfer- ase activity was found to be enriched 1621 fold in the EF-2 fraction purified to homogenity on isoelectric focusing - *..., *: