Protein sentezinin düzenlenmesi üzerine çalışmalar

Abstract

102 V. ÖZET Tavşan retikülosit özütlerinde protein sentezi için uygun koşulların belirlenmesi amacıyla, sistemin öğelerinin 2+ sentez etkinliği üzerine etkileri incelenmiştir. Hemin, Mg, + K, ATP ve GTP'nin sistemin etkinliği için elzem öğeler olduğu saptanmıştır. Özütlere dışarıdan eklenen cAMP, EADPK, NAD, RKAz inhibitörü `RNAzin` ve eIF-2'ninde sentez etkinliğini arttırdığı ve hemoglobin içeriği azaltılmış özü'tlerin protein sentezinin kontrole kıyasla daha hızlı ve etkin olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, hemoglobinden arındırılmış retikülosit özütlerinin de kontrol özütlere oranla protein sentezinde daha etkin oldukları bulunmuştur. Çalışmanın ikinci bölümünde, oksitlenmiş glutatiyona (GSSG) tabi tutulmuş retikülosit özütlerinde oluşan, ve hiperoksi ve ısı şoku gibi baskı koşullarında da ortaya çıkan bir inhibitor, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ile kıs men saflaştırılaış ve tanımlanmaya çalışılmıştır. Bu çalışmalarda elde edilen kesimin daha önceki çalışmalarda hP02 altın da etkinleşen ^23 kDa molekül ağırlıklı inhibitöre karşılık geldiği düşünülmüştür. Retikülosit özütlerinde inisiyasyon faktörü 2 (eIF-2) kesiminin düşük deri simlerinin varlığında, etkisi tamamen ortadan kalkan bu inhibitor, eritrosit özütlerinde baskı koşulu olmaksızın da etkin olarak bulunmuştur. Bu inhibitörün eritrosit hücrelerin olgunlaşmasındaki olası rolü tartışılmıştır.103 Çalışmanın üçüncü bölümünde ise, protein sentezinin düzenlenmesinde, elongasyon faktörü 2 (EP-2) nin fosforillenmesiyle değişik deney koşulları arasındaki ilişki `52 y -P-ATP varlığında tavşan retikülosit özütlerinde incelenmiştir. Isı şoku ve hiperoksi ile SDü-poliakrilamit gel elektroforezi sonrası E3?-2*ye karşılık gelen M ~V5 kDa bandında sinyal şiddeti belirgin biçimde artarken, oksitlenmiş glutatiyon ve ADP-ribozi İlenmenin belirgin bir değişime yol açmadığı gözlenmiştir. GDP eklenmesi ile bu bandın fosforillenmesi belirginleşmiş, ancak N-etilmaleyimit ile' M ^9^' kDa 32 bandının P-içeriği tümüyle ortadan kalkmıştır. Ayrıca, kısa bir süre önce yayınlanan çalışmalarla uyumlu olarak, cAKP varlığında bandın sinyal şiddetinde azalma gözlenmiştir. Veriler EF-2'nin fosforillenmesinin ve defosforillenmesinin polipeptit zincirlerinin sentezinde düzenleyici bir rol oynama olasılığını sezindirmektedir.

104 VI. SUMMARY A cell-free protein synthesizing system `based on rabbit reticulocyte lysates was optimized. It was shown that hemin, + 2-f- ATP, GTP, K and Mg are essential for the activity of the system. The addition of cAMP, NADPH, NAD, REAase inhibitor `RNAsin` and eIF-2 enhanced further the protein synthetic activity of the system. It was also shown that the activity of protein synthesis in hemoglobin-free rabbit reticulocyte lysate was higher than that of the control lysate. An inhibitor of protein synthesis, which appears to be activated in rabbit reticulocyte lysates under various stress conditions, like high oxygen partial pressure, presence of glutathione disulfide and heat treatment, was also partially purified and characterized. The findings of the study indicate that a similar inhibitor may exist in spontaneously activated state in rabbit erythrocyte lysates. The activation of the inhibitor is discussed in terms of its role in the final maturation stage of the erythroid cell. The effects of various experimental conditions on the phosphorylation state of elongation factor 2 (EF-2) were also studied in the presence of Y J -P-ATP in rabbit reticulocytes. The phosphorylation of elongation factor 2 (EF-2) was very strongly inhibited by the addition of cAMP and KEM. It was enhanced in the presence of heat shock, hP02, and GDP. No change was observed in the presence of GSSG and ADPR-EF-2.105 The results suggest that phosphorylation/dephosphorylation of EF-2 may play an important role inthe regulation of chain elongation in eukaryotic cells.