Tavşan embryolarının gelişmesinde in vitro kültür mediumunun etkisi

Abstract

- 64 - 7. ÖZET Bu çalışma maksimal embryo gelişimi için gerekli opti mal serum konsantrasyonunu belirlemek amacıyla gerçekleştirildi. 2 hücreli embryolar 24 saat ara ile üç enjeksiyonda toplam 75 Iü HMG(Human Menopausal Gonadotrophin, Humegon, Orga- non) verilip, son HMG enjeksiyonundan 24 saat sonra iv. olarak 100 Iü LH(Pregnyl, Organon) uygulaması ile ovulasyonları sağlanan ve çiftleştirilen tavşanlardan kazanıldı. Kazanılan embryolar TCM 199(A), TCM 199 + %5 sığır serumu(B), TCM 199 + %10 sığır serumu (C) ve TCM 199 + %15 sığır serumu(D) olmak üzere 4 farklı medium- da kültüre edildiler. Dört bölmeli kültür kapları kullanılarak (Nunk, Inter- Med) her bir bölmede ayrı uygulama grubu içinde sırasıyla A me- diumunda 61, B mediumunda 58, C mediumunda 57 ve D mediumunda 58 embryo kültüre edildi. Kültür kaplarının her bir bölmesine, üzeri herhangi bir yağ tabakası ile örtülmeksizin 1 mi kültür mediumu konuldu. Embryolar mediumlara yerleştirildikten sonra 37°C'da ve %5 C02r %s o2 ve %90 N gaz karışımında 96 saat süre ile her 24 saatte kontrolları ve medium tazelemeleri yapılarak kültüre edildiler. Kültürde ilk 24 saat sonunda serum içeren ve içermeyen mediumlardaki embyonal gelişimler arasında pek bir fark gözlenme di. Bu sırada her uygulama grubundaki embryoların %50'den fazlası morula safhasına gelişmişti. Halbuki, in vitro kütürün 48. saa tinde A medimundaki embryolar kompakt morula safhasına kadar ge-- 65 - lipebilirken, B, C ve D mediumundaki embryolar erken blastosist/ blastosist safhalarına kadar gelişebildiler. A mediumu ile diğer mediumlar arasındaki periodik ve total gelişim farklılıkları is tatistik açıdan oldukça önemli bulundu(mediumlara göre sırasıyla periodik gelişimler P< 0.001, P<0.02, P<0.005 ve total gelişimler P<0.005, P <0.05 ve P< 0.005). B, C ve D mediumları arasında olu şan farklılıklar ise önemsiz bulundu. A mediumundaki embryoların çoğunluğu 72 saat sonunda dejenere olurken veya gelişemezken diğer gruplardaki embryoların bu dönemde gelişimine devam ettiği gözlendi. A grubundaki perio dik ve total gelişimler B, C ve D mediumlarına göre oldukça düşük olarak şekillendi (bütün mediumlar için P< 0.001). Bu arada B ve C gruplarındaki embryoların periodik ve total gelişimleri birbirine yakın gerçekleşirken C mediumundaki ler in daha iyi geliştikleri belirlendi. Diğer taraftan B ve C mediumundaki gelişimler D mediumundaki gelişimler ile karşılaştırıldığında önemli derecede düşük oldukları tesbit edildi (sırasıyla periodik gelişimler için P< 0.001 ve P< 0.02, total gelişimler için P< 0.005 ve P< 0.02). 96 saatlik süre sonunda B, C ve D mediumlarındaki emb ryolar yüksek oranda geliştikleri halde A mediumundaki bütün emb ryoların dejenere olduğu gözlendi (P< 0.001). Aynı süre içinde C mediumunda B'ye göre daha iyi gelişme sağlanmasına karşın ista tistik açıdan önemli değildi. Ancak D mediumundaki periodik ve total gelişimlerin diğer iki mediuma göre oldukça üstün olduğu tesbit edildi (mediumlara göre sırasıyla P< 0.001 ve P<Û.ÜÜ5).- 66 - Çalışmanın sonuçları 2 hücreli tavşan embryolarmın in vitro olarak yeteri kadar gelişimini sağlamak için TCM 199 mediu- munun 24 saatlik sürenin üzerindeki inkübasyonlarda yetersiz ol duğunu ve serum eklentisinin mutlak gerekli olduğunu ortaya çı kardı* Aynı zamanda inkübasyon süresi ile serum konsantrasyonunun direk bağlantılı olduğu ve süre uzadıkça serum oranının artırıl ması gerektiği ortaya çıktı. Sonuç olarak tavşan emryolarmın TCM 199 mediumunda en iyi şekilde kültüre edilebilmesi için sığır se rumunun %15 oranında katılması gerektiği anlaşıldı.

- 67 - 8. SUMMARY This study was undertaken to determine the optimal con centration of serum necessary for maximal embryo development» 2 cell stage embryos (N= 234) were recovered from superovulated does injected im. 75 IÜ with Human menopausal gonadotrophin(Humegon; Organon) divided in three doses injected after every 24 h and ovulation induced by injecting 100 10 LH( Pregnyl; Organon) iv. 24 h after the last HMG injection. Embryos were cultured in four media as follow: TCM 199(A), TCM 199 + 5% bovine serum(B), TCM 199 + 10% bovine serum(C), TCM 199 + 15% bovine serum(D). 61, 58, 57 and 58 2 cell embryos were cultured in media A, B, C and D, respectively, in Nunc Four Well dishes. Each well was filled with 1 ml of each medium without any oil cover. Incu bation was carried out at 37°C in a humidified 5% CO-, 5% 0 and 90% N gas mixture. Observations were made and media were changed after every 24 h till 96 h. During the first 24 h of culture there was no differ ence in the growth rate between serum suplemented media and medium without serum. More than 50% of embryos in each medium reached the morula stage. However, after 48 h of incubation the periodic and total developmental rate was significantly better in serum supplemented media than medium without serum(P<0.001/ <0.02, <0.005 for periodic growth rates; <0.005, < 0.05 and <0.005 for total growth rates in B, C and D media respectively).- 68 The difference among B, C and D media was non significant. The embryos in A medium reached upto compact morula stage but in B, C and D media were at early blastocyst/blastocyst stage after the 48 h of incubation. After the end of 72 h of incubation most of the embryos in medium A either had dejenerated or had not developed further whereas in serum supplemented media they had progressed further. The periodic and total growth rates for A medium were signifi cantly lower than B, C and D media(P< 0.001 for B, C and D). Although, there was non significant difference between B and C media but the periodic and total growth rates were better in C than B medium. The medium D differed significantly than B and C media as regards the periodic and total growth rates (P< 0.001> < 0.02 for periodic and < 0.005, <0.02 for total growth rates). At the end of 96 h of incubation all the embryos in medium A had undergone degeneration whereas those in B, C and O media were still developing to hatching/hatched blastocyst stage. B, C and D media differed significantly than A medium as regarded the total and periodic growth rates(P< 0.001). Again B and C differed non significantly but C had bet ter values. Both of them had significantly lower periodic and total growth rates than D medium(P< 0.005, <0.05 for periodic and < 0.001, <0.005 for total growth rates respectively). The results of study showed that after 24 h of incuba tion TCM 199 alone was unable to support the 2 cell rabbit embryo- 69 - development sufficiently and it was necessary to add serum in the medium. It was also noted that with increasing incubation period the developmental rate was directly related with the increased concentration of serum. So it was concluded that for maximum development of the rabbit embryos in TCM 199 medium serum should be added at a concentration of 15 percent.