Tavşanlarda uterus yıkaması yöntemi ile elde edilen embryoların kalite ve kantitesi üzerine bazı süperovulatör ajanların etkileri

Abstract

58 6. ÖZET Tavşanlarda en uygun süperovulatör preparatı seçmek için planlanan bu çalışmada, PMSG, HMG, C.C. preparatlar ının farklı uygulama ve dozlarının etkileri toplam 7 deneme ve bir kontrol grubunda araştırıldı. Süperovulaayon çalışmaları amacıyla her grup için 10'ar tavşan olmak üzere toplam 80 dişi ve bu hayvanların tohumlanmasında 8 erkek tavşan kullanıldı. En iyi sonuçları veren süperovulatör preparat ve dozun seçiminden sonra, bu preparatın gebelik oranı üzerine olan etkisini değerlendirmek amacıyla da toplam 25 dişi tavşanın kullanımı planlandı. PMSG'nin 75, 150 ve 200 iü. dozları tek enjeksiyon şeklinde HCG ile kombineli olarak uygulandı ve aplikasyondan 96 saat sonra laparatomi ile ovaryumlardaki oluşumlar tespit edilerek hayvanların tümünde uterus yıkaması gerçekleştirildi. 75 iü. PMSG verilen gruptaki tavşanların ovaryumlar ında ortalama 36.6+_7,99 adet oluşum (follikül + korpus luteum) saptanırken, bunlardan ortalama 7.4+_2,28 tanesi patlamamış follikül, 29.2±5.71 tanesi ise korpus luteum idi. Bu grupta ovulasyon oranı %79.78 olarak bel irlendi. 150 iü. PMSG grubunda bu değerler ortalama 41.1+_10.39 toplam oluşum, 13.5+_3,49 follikül, 27.0+6t90 korpus luteum şeklinde iken, ovulasyon oranı ise %66.67 oldu. 200 iü. PMSG grubundaki değerler ortalama 32. 4+9,41 toplam oluşum, 9.2+_2*61 follikül ve 23.2+6,80 korpus luteum olarak belirlenirken, ovulasyon oranı da %71.60 olarak saptandı. HMG'nin 75 iü. olarak tek enjeksiyonla uygulandığı grupta ortalama 51.3+9,95 olucum saptanırken, bunların 8,5+3.65 adeti patlamamış follikül, 42.8+_ç,,30 tanesi ise korpus luteum olarak59 belirlendi ve ovulasyon oranı da %83.43 oldu. HMG'nin üç enjeksiyonla verildiği grupta ise ortalama 51.1+_n,85 toplam oluşum, 4.4+_1,61 follikül, 45.7+_10,24 korpus luteum saptandı ve ovulasyon oranı da %91.39 olarak belirlendi. C.C.'ın per os 100 mg. dozda verildiği grupta ortalama 11.6+_2.61 adet oluşum saptanırken, bunların 6.0+_l.16 tanesinin follikül, 5. 6+_ 1 45' inin ise korpus luteum olduğu belirlendi ve ovulasyon oranı %48.28 olarak tespit edildi. 150 mg. C.C. verilen grupta ise bu değerler 12.6 + 2,43 toplam oluşum, 7.7+.1.54 patlamamış follikül ve 4.9+0,89 adet korpus luteum seklinde iken, ovulasyon oranı da %38.89 olarak saptandı. Sadece 100 iü. HCG'nin ovulasyonu stimüle etmek amacı ile verildiği kontrol grubunda ise ortalama 10.5+_ı,54 adet oluşum, bunların 3.1+_o47g adeti patlamamış follikül, 7,4+0,76 adeti de korpus luteum şeklinde değerlendirilirken, ovulasyon oranı %70.48 olarak hesaplandı. Yapılan uterus yıkamaları sonucunda, 75 iü. PMSG grubunda hayvan başına ortalama 19.7+_6.07 adet hücre kaşanıldı ve bunlardan 7.77+_4,35 adetinin ovum ve dejenere embryo, 12.7 + 5.32 tanesinin de sağlıklı embryo olduğu belirlendi. Sağlıklı embryoların (toplam 127 adet) 1 tanesi kompakt morula, 17' si blastosist, 24'ü geç blastosist, 85 adeti de expanded blastosist gelişim devrelerindeydi. 150 iü. PMSG grubunda hayvan başına ortalama 3.4+_ı,75 adet hücre kazanılırken, bunlardan 2.1+_ı,62 adeti ovum ve dejenere embryo, l.3+_0.73 tanesi ise sağlıklı embryo olarak değerlendirildi. Sağlıklı embryolar (toplam 13 adet), 2 kompakt morula, 7 blastosist, 2 geç blastosist ve 2 adet expanded blastosist gelişim dönemindeydi. 200 iü. PMSG grubunda ise hayvan başına ortalama 6.1+2.17 adet hücre kazanılırken, 5.5+1,75 tanesi ovum ve dejenere embryo.60 0.6+0.42 adeti da sağlıklı embryo olarak belirlendi. Sağlıklı embryoların (toplam 6 adet) gelişim devreleri ise, 1 adet kompakt morula, 1 adet blastosist, 3 adet geç blastosist ve 1 adet expanded blastosist idi. HMG'nin tek enjeksiyonla verildiği grupta ise ortalama 20.8+_5,53 adet hücre kaşanıldı ve bunlardan 5.7+_l.73 tanesi ovum ve dejenere embryo, 15.lj_6.24 tanesi ise sağlıklı embryo olarak belirlendi. Sağlıklı embryoların (toplam 151 adet) gelişim devreleri ise 6'sı kompakt morula, 18'i blastosist, 22'si geç blastosist ve 105 tanesi de expanded blastosist olarak değerlendir ildi. Üç enjeksiyonla HMG verilen grupta ise ortalama 22.8+_5,80 adet hücre kazanılırken, bunların 11-7+_2,53 tanesi ovum vs dejenere embryo, ortalama 11.1+6,23 tanesi da sağlıklı embryo olarak belirlendi. Sağlıklı embryoların (toplam 111 adet) gelişim devreleri ise 1 kompakt morula, 57 blastosist, 17 geç blastosist ve 36 adet expanded blastosist dağı l ımındaydı. En az hücre kazanımının gerçekleştiği C.C. grubunda ise, 100 mg. C.C. 'in verildiği tavşanlardan ortalama 1.2+_o.55 hücre kazanılırken, bunların 0.4+_o.04'ü ovum, 0.8+0.51'i de sağlıklı embryo olarak değerlendirildi. Sağlıklı embryoların (toplam 8 adet) gelişim devreleri ise, 2 blastosist, 1 geç blastosist ve 5 adet de expanded blastosist şeklindeydi. 150 mg. C.C. grubunda ise ortalama 0.6+Q.26 hücre kaşanıldı ve bunların tamamının ovum ve dejenere embryo olduğu görüldü. Kontrol grubunda ortalama 3.3+j.,05 hücre kaşanıldı ve bunlardan 0.9+_o«54 tanesinin ovum ve dejenere embryo, 2.4+_ı,08' inin de sağlıklı embryo olduğu saptandı. Sağlıklı embryoların (toplam 24 adet) gelişim devreleri ise, 3 kompakt morula, 5 blastosist, 2 geç blastosist, 14 adet expanded blastosist dağılı mındaydı.61 PMSG'nin 75, 150 ve 200 iü. dozlarında verildiği gruplarda elde edilen f ertili zasyon oranları sırasıyla %97.97, %97.06 ve %83.61 olarak saptandı. HMG'nin tek enjeksiyonla verildiği grupta f ertil izasyon oranı %91.83 iken, 3 enjeksiyonla verildiği grupta %75.00 oldu. C.C. uygulamasında ise f ertili zasyon oranları, 100 ve 150 mg. C.C. uygulamalarında sırası ile %66.67 ve %16.67 oldu. Aynı oran kontrol grubunda ise %93.94 olarak saptandı. Tavşan embryolarının expanded blastosist gelişim devresi, 96 saatlik embryoların bulunması gereken süreye denk kabul edildiği için, bu devredeki embryoların toplam sağlıklı embryolar içindeki oranı hesaplandı ve bu oran 75, 150 ve 200 iö. PMSG gruplarında sırası ile %66.93, %15.38 ve %16.67 iken, 3 enjeksiyonla HMG verilen grupta %32.43, tek enjeksiyonla HMG verilen grupta ise %69.54 olarak saptandı. Aynı gelişim devresindeki embryoların dağılım oranları 100 mg. C.C. grubunda %62.50, 150 mg. C.C. grubunda 0 ve kontrol grubunda ise %58.33 oldu. Elde edilen veriler ovaryumlardaki toplam oluşum, kazanılan sağlıklı embryo sayıları ve expanded blastosi st ler in oranı açısından incelendiğinde, uygulama grupları arasında tek enjeksiyonla 75 iü. HMG verilen grubun üstün olduğu saptandı. Üvulasyon oranı açısından ise 3 enjeksiyonla HMG verilen grubun daha üstün olduğu belirlendi. Fertil izasyon oranı yönünden sonuçlar incelendiğinde, tek enjeksiyonla HMG uygulanan grupta elde edilen verilerin, kontrol grubuna yakın olduğu, 75 ve 150 iü. PMSG verilen grupların sonuçlarından ise daha düşük olduğu görüldü. Bu verilerin ışığında HMG'nin tek enjeksiyonla uygulanan 75 iü.lik dozu, planlanan embryo transfer çalışmalarında en iyi sonuç veren süperovulatör ajan düşüncesi ile kullanıldı ve bu preparatın gebelik oranı üzerine olan etkisi araştırıldı. Bu62 maksat ile HMG uygulama grubunda 5 verici 10 alıcı, kontrol amacıyla da 5 verici 5 alıcı olmak üzere toplam 25 tavşanın embryo transfer çalışmalarında kullanılması planlandı. Uygulama grubundaki 5 verici tavşandan çiftleşmeden 96 saat sonra uygulanan uterus yıkaması ile elde edilen 65 embryonun (hayvan başına ortalama 13.0+_e403) değerlendirilmesi sonucu, 1 tanesinin dejenere olduğuna karar verildi. Toplam 64 sağlıklı embryonun ? alıcı tavşana transferinden hiçbir gebelik elde edilemedi. Kontrol grubunda ise 5 verici tavşandan kazanılan 27 adet embryonun (hayvan başına ortalama 5.4_+2.29) incelenmesi ile 1 tanesinin dejenere olduğu görüldü. Sağlıklı olan toplam 26 embryonun 3 alıcı tavşana transferinden bir gebelik elde edildi.

63 7. SUMMARY In order- to select the most suitable superovulator agent in rabbits, different doses of PMSG, HMG and C.C. were investigated on seven treatment groups, and a control group. Each of every 8 ovulation groups contained ten female rabbits and 8 male rabbits were used for matings. Choosing the most effective superovulator agent, 25 female rabbits were kept to evaluate the effect of this agent on pregnancy rates. 75, 150 and 200 iü. doses of PMSG were treated combined with HCG by single enjection, and 96 hours apart, ovarial findings were observed by laparatomy and all uteri were flushed. In the 75 iü. PMSG treatment group, total ovarial findings (follicle + corpus luteum) were 36.6+7,99, Out of these, 7.4+2.28 were unovulated follicles, 29.2+5,71 were corpora lutaa. The ovulation rate for this group was 79.78%. These values for the 150 iü. PMSG group were 41.1+J.Q.39 total findings, 13.5+_3.4g follicles, 27.0 + 5.90 corpora lutea, and the rate of ovulation was 66.67%. The values of the 200 iü. PMSG group were 32.4+_9,4i total findings, 9.2+_2.51 follicles and 23.2+5.80 corpora lutaa, and the rate of ovulation was 71.60%. In the group at which 75 iü. HMG was used by single injection, the mean values were ati follows, 51.3+_g.95 total findings, 8.5+_3,65 unovulated follicles, 42.8 + 6.30 corpora lutea and the rate of ovulation was 83.43%. In the group at which HMG was treated by 3 injections there were 51.1+_n,85 total findings, 4.4+_i,6i follicles, 4S.7+J.0.24 corpora lutea and the rate of ovulation was 91.39%. In the group at which 100 mg. C.C. was used by oral route, there were 11.6+_2,51 total findings, out of these 6.0+.1.15 were64 follicles, 5.6+^,45 wsr9 corpora lutea and the ovulation rata was 48.28%. At 150 mg. C.C. treated group, these values were 12.6+^.43 total findings, 7.7+.1.54 unovulated follicles, 4.9+0.89 corpora lutea, and the ovulation rate was 38.89%. In the control group which was treated only by 100 iü. HCG to stimulate ovulation, there were lU.bu.54 total findings. Out of these 3. 1+^.78 were unovulated follicles. 7.4+.0.76 were corpora lutea and ovulation rate was 70.48%. At the 75 iü. PMSG group, avarage 19.7+_s,07 cell3 were recovered per animal by uterus flushings. Out of those cells 7.77+_4,35 were ova and degenerated embryos. The total number of healthy embryos was 127. Out of those embryos 1 was compact morula, 17 blastocysts, 24 late blastocysts and 85 were expanded blastocysts. In the 150 iü. PMSG treated group, avarage 3.4+_j,,75 total findings were noted per animal. Out of those findings 2.1+_i,62 were ova and dejenerated embryos and 1.3+_o.73 were healthy embryos. Number of healthy embryos was 13, and 2 were compact morula, 7 were blastocysts, 2 late blastocysts and 2 were expanded blastocysts. In the 200 iü. PMSG treated group, avarage 6.1+^.17 cells were recovered per animal. Out of those findings 5.5+_i,75 were ova and dejenerated embryos and Û.S-M3.42 were healthy embryos. Out of the total 6 healthy embryos, 1 was compact morula, 1 was blastocyst, 3 were late blastocysts and 1 was expanded blastocyst. In the HMG single injection group, avarage 2Û.8+_5,63 cells were recovered. Out of these cells 5.7+_i,73 were ova and dejenerated embryos, and 15.1+_6.24 were healthy embryos. Total number of the healthy embryos was 151 and their developmental stages were as follows, 6 were compact morula, 18 were blastocysts, 22 were late blastocysts and 105 were expanded65 blastocysts. In the group which is treated by 3 injections of HMG, avarage 22.8+^.go cells were recovered* Out of these cells 11.7+^2*63 were ova and dejenerated embryos, and 11.1+.6.23 were healthy embryos. Total number of healthy embryos was 111 and their developmental stages were as follows, 1 compact morula, 57 blastocysts, 17 late blastocysts and 36 expanded blastocysts. In the least cell recovered C.C. group, from the 100 mg. C.C. treated does avarage 1.2+_o«55 cells were recovered. Out of those cells 0.4+_o*04 were ova, 0*8 + 0. 51 were healthy embryos. Total number of healthy embryos were 8 and their developmental stages were as follows, 2 blastocysts, 1 late blastocyst and 5 were expanded blastocysts. In the 150 mg. C.C. group avarage 0.6+_o*25 celİ3 recovered and all of those cells were ova and dejenerated embryos. In the control group avarage 3.3+_i,05 cells were recovered. 0.9+_o.54 of those cells were ova and dejenerated embryos and 2.4+_i,08 were healthy embryos* Total number of healthy embryos was 24. Developmental stages of those embryos were 3 compact morula, 5 blastocysts, 2 late blastocysts and 14 expanded blastocysts. In the groups treated with 75, 150 and 200 iü. doses of PMSG, rates of fertilization were 97.97%, 97.06% and 83.61% respectively. In the HMG single injection group, rate of fertilization was 9î.83% and in HMG 3 injections group it was 75.00%. In C.C. treated groups, rates of fertilization were as follows. In 100 mg. C.C. group 66.67% and in 150 mg. C.C. group 16.67%. In the control group, rate of fertilization was 93.94%. Since expanded blastocyst stage of rabbit embryos is considered equal to the developmental stages of 96 hours embryos, the rate of this stage embryos were calculated over the total66 healthy embryos and these rates for 75, 150 and 200 iti. PMSG groups were 66.93%, 15.38% and 16.67% respectively. This rate «as 32.43% for 3 injections HMG group and 69.54% for single injection HMG group. Rates of the embryos at same developmental stages were 62.50% for 100 mg. C.C. group, 0% for 150 mg. C.C. group and 58.33% for control group. Among the results of experiments, when total findings, recovered healthy embryos and rate of expanded blastocysts were considered 75 iü. HMG single injection group found supperior to others. When fertilization rates were compared HMG single injection groups results found to be close to the results of the control group and lower than the results of 75 and 150 iü. PMSG groups. Considering these results, single injection of 75 iü. HMG was used for superovulation in the embryo transfer investigations and its effect on pregnancy rates was examined. For this purpose, for HMG treatment 5 donor and 10 recipient rabbits and for control group 5 donor and 5 recipient rabbits were used. In the treatment group, 96 hours after mating, 65 embryos recovered by uterus flushings of 5 donor rabbits( avarage 13.0+_5,Q3 per animal). 1 embryo was dejenerated and other 64 embryos were transferred to 7 recipients. No pregnancy was obtained. In the control group, total 27 embryos recovered from 5 donor rabbits (avarage 5. 4+3*29 per animal), 1 of the embryos was dejenerated. Other 26 healthy embryos were transferred to 3 recipient rabbits and one pregnancy obtained.