Suda eriyen dana lensi proteinleri üzerine kalsiyum ve glikozun etkileri

Abstract

ÖZET Bu çalışmada, değişik konsantrasyonlarda, kalsiyum ve glikozun suda eriyen lens proteinleri üzerine etkileri incelendi. Materyal olarak, mezbahadan alınan dana gözleri kullanıldı. 6 adet dana lensi, homojenize edildi ve yüksek devirde santrifüje edilerek suda eriyen fraksiyon ayrıldı. Supernatantın protein konsantrasyonu belir lendi ve 25 mg/ml. olacak şekilde dilüsyon yapıldı. Kullanılan kalsiyum konsantrasyonları, normal insan lensi kalsi yum düzeyinin katları olarak belirlendi. Glikoz konsantarsyonları normal insan kan glikoz düzeyi (100 mg/dl) ve hiperglisemik insan kan düzeyi (400 mg/dl) örnek alındı. 25 mg/mlt olarak hazırlanan, suda eriyen lens protein örneklerin de, değişik konsantrasyonlarda kalsiyum ve glikoz örneklerinden 100 /il ola rak eklendi. Birinci grup deneylerimizde, örnekleri absorbansları sıfırıncı günden itibaren 550 nm'de spektrofotometrede okundular ve 37° C'de inkü be edildiler. Yine 4 gün süreyle aynı saatte, inkübasyondan elendiler ve spektrofoometrede absorbansları okunarak kaydedildi.İkinci grup deneylerimizde, değişik konsantrasyonlarda kalsiyum ve glikoz içeren suda eriyen lens proteinleri 48 saat süreyle 37° C'de inkü be edildiler. Daha sonra inkübasyondan alınarak HPLC (yüksek basınçlı sıvı kromatografisi) uygulaması için -70° C'de korundular. Kalsiyum ve glikozun suda eriyen lens proteinlerinde meydana getirdiği değişiklikleri, son deneyimizde Laemmli poliakrilamid gel elektro forezi ile inceledik. Birinci grup deneylerimizde, 4 gün süreyle elde ettiğimiz absor bansların günlere göre değişimini grafiklerle gösterdik. Kalsiyum konsan trasyonu arttıkça, absorbanslarda da artış olduğunu belirledik. Kalsiyum örneklerine eklenen 5.5 mM ve 22 mM glikoz ile bu artış daha da belirgin- leşti. En yüksek artış 22 mM glikoz eklediğimiz gruplarda elde ettik. İkinci grup deneylerimizde, değişik konsantrasyonlarda kalsiyum ve glikoz içeren lens proteinlerini ayrı ayrı HPLC'ye vererek, suda eriyen lens proteinlerinde ve fraksiyonlarında meydana gelen değişimleri incele dik. Kalsiyum konsantrasyonu arttıkça, suda eriyen lens proteinlerinde bir azalma olduğunu belirledik. En fazla azalmayı 50 mM kalsiyum içeren grup ta saptadık. Benzer şekilde glikoz içeren örneklerde de, kontrol grubuna göre, suda eriyen lens protein miktarında bir azalma olduğunu belirledik. En fazla azalma 22 mM glikoz içeren grupta elde edildi. Bu iki ayrı grup deneylerimizden, kalsiyumun ve glikozun suda eriyen lens proteinlerinde agregatlaşmaya neden olduğu ve bu proteinlerin miktarında azalma meydana getirdiğini gösterdik. Gerek kalsiyum, gerekse glikozun konsantrasyonlarının artması ile agregatlaşma daha artmakta, suda eriyen proteinlerde daha fazla azalma meydana gelmektedir. Kalsiyum ve glikozun, birlikte inkübasyonları ile bu agregatlaş ma daha da artmaktadır. Kalsiyum ve glikozun suda eriyen lens proteinlerinde meydanagetirdiği değişimleri Laemmli poliakrilamid gel elektroforezi ile incelediği mizde, düşük konsantrasyonlarda kalsiyum içeren gruplarda (0.001 mM, 1 mM), inkübasyon sonrasında bir farklılık elde edilmedi. 10 mM kalsiyum ve 22 mM glikoz içeren lens proteininde 7 nolu bandın koyuluğunda artma, 50 mM kalsiyum ve 5.5 mM glikoz içeren grupta 5 ve 6 nolu bandların koyuluğunda azalma olduğunu, 50 mM kalsiyum ve 22 mM glikoz içeren grupta ise hem 5 ve 6 nolu, hem de 7 nolu bandın koyuluğunda azalma olduğunu gözledik. Bu bulgular artan kalsiyum ve glikoz konsantrasyonu nun, düşük molekül ağırlıklı proteinlerin agregatlaşmasına ve bu proteinle rin daha yüksek molekül ağırlıktaki proteinlere dönüşmesine neden olduğu şeklinde yorumlanmıştır.

61 SUMMARY In this study, effects of calcium and glucose on water soluble lens proteins were studied at various concentrations. Calf lenses, obtained from slaughterhouse, were used as study material. Six calf lenses were homogenized and water soluble fractions were seperated by high speed centrifugation. Protein concentration of supernatant was determined and diluted to a final concentration of 25 mg/ml. Calcium concentrations used in the study were determined by multiplications of normal level in human lens. Glucose concentrations used were normal (100 mg/dl) and hyperglycemic (400 mg/dl) human blood levels. 100 fil solutions of varying concentrations of calcium and glucose were added to water soluble protein specimens, concentration of which was 25 mg/ml by spectrophotometry at 550 nm. In our first group of experiments, absorbances of specimens were determined begining from day 0 and they were incubated at 37°C. With 24 hour intervals for four days, some specimens are removed from incubation and their absorbances were determined by spectrophotometry.62 In second group of experiments, water solubel lens protenis containing various concentrations of calcium and glucose were incubated at 37°C for 48 hours. After incubation specimens were kept at -70°C until performance of high pressure liquid chromatography (HPLC). In our last experiment we determined changes in water soluble lens proteins caused by calcium and glucose, by Laemmli polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). In the first group, changes in absorbances determined for four days were demonstrated in graphics. We observed that increased levels of calcium led to increased absorbance values. After addition of 5.5 mM and 22 mM glucose to calcium containing specimens this increase became more obvious. Highest increase was recorded in specimens in which 22 mM glucose was added. In the second group, lens protein specimens containing varying concentrations of calcium and glucose were investigated by HPLC for changes in water soluble lens proteins and fractions. Water soluble lens protein concentrations were decreased with increased concentrations of calcium. Highest decrease was observed in specimens containing 50 mM calcium. Similarly, amount of water soluble proteins were decreased in specimens containing glucose compared to control group. Highest decrease was determined in specimens containing 22 mM glucose. In this two groups of experiment, we demonstrated that calcium and glucose led to formation of aggregates by water soluble lens proteins and decrease in amounts of these proteins. With increased concentrations of both calcium and glucose, aggregate formation increases and amount of water soluble lens proteins decreases. Aggregate formation increases even more when incubation performed with calcium and glucose together.63 When changes in water soluble lens proteins caused by calcium and glucose were investigated by PAGE no changes were observed in specimens containing low concentrations of calcium (0.001 mM and 1 mM). Increase in darkness of band 7 in lens protein specimen containing 10 mM calcium and 22 mM glucose and both decrease in darkness of bands 5 and 6 and increase in darkness of band 7 in specimen with 50 mM calcium and 22 mM glucose, were observed. It was concluded that increased concentrations of calcium and glucose lead to aggregation of low molecular weight proteins and thus formation of high molecular weight proteins.