Transgenik fare eldesine yönelik çalışmalar

Abstract

Sunulan çalışmada iki farklı gen konstraktı kullanılarak transgenik fare elde edi lmesi amaçlandı. Bu doğrultuda araştırma, farelerede süperovulasyon, embriyoların kaza nılması, kazanılan embriyolara mikroenjeksiyon tekniği ile gen transferi, gen transferi yapılmış embriyoların alıcı (recipient) annelerin oviduktuna cerrahi yol ile transferi ve transferden doğan yavruların, transgenik analiz yöntemleri kullanılarak tespit edilmesi olmak üzere 5 aşamada gerçekleşti. Bu çalışmada CB6 hibrid (Fİ) ırk farelerden 146'sı verici ve 38'i alıcı olmak üzere toplam 184 adet fare kullanıldı. Damızlık olarak aynı ırktan 30 erkek, alıcıların senkro nizasyonu için de 30 vazektomize fare kullanıldı. Sunulan çalışmada, verici farelerin süperovulasyonlan 5'er LU PMSG ve hCG hormonları uygulanarak gerçekleştirildi. Vericilerden elde edilen zigotların erkek pronuk- leuslanna l'nci grupta pXGH5, 2'nci grupta p53-248 gen konstraktlan mikroenjeksiyon tekniğiyle verildi. Bu zigotlar alıcı (recipient) annelerin oviduktuna cerrahi yol ile transfer edildi. Transferden doğan yavruların transgenik kontrollan Dot-Blot hibridizasyon yöntemi ile yapıldı. Her iki deney gruplarında alman sonuçlar toplu olarak şöyle bulundu: 1. grupta 1470 zigot elde edildi ve bu zigotlardan 1269'una (%86.32) mikroenjeksiyon ile pXGH5 geni verildi. Bu zigotlardan 769'unun (%60.59) canlı olduğuna karar verildi ve 420'si (%54.61) alıcı annelerin oviduktuna transfer edildi. Yapılan bu transfer sonunda 70 yavru (% 16.66) elde edildi. Yapılan transgenik kontrollerde elde edilen yavrulardan 3'ünün (%4.28) transgenik olduğu belirlendi. 2. grupta 1246 zigot elde edildi ve bu zigotlardan 1020'sine (%81.86) mikro enjeksiyon ile p53-248 geni verildi. Bu zigotlardan 601'inin (%58.92) canlı olduğuna karar verildi ve 400'ü (%66.55) alıcıların oviduktuna transferi edildi. Transfer sonunda 105 (%26.25) yavru elde edildi. Yapılan transgenik kontrollerde elde edilen yavrulardan 6'sının (%5.71) transgenik olduğu saptandı.70 Her iki grup kendi içlerinde contingency Chi-square test istatistik yöntemiyle kar şılaştırıldı ve şu sonuçlar elde edildi. Her iki grupta mikroenjeksiyon yapılan zigotların canlılık oranlan karşılaştırıldığında istatiksel anlamlılık bulunamadı (P>0.05). İki grup doğum oranlan bakımından karşılaştınldığmda ise p53-248 geni uygulanan grup lehine istatiksel bir anlamlılık görüldü (P< 0.001). Doğum oranlan yönünden 1. grup kontrol grubu ile karşılaştınldığmda, deney grubunun oranlan önemli derecede düşük bulunurken (P< 0.001), 2. grup ile kontrol grubu arasında doğum oranlan yönünden önemli bir fark oluşmadığı görüldü. Son olarak her iki grup kendi içlerinde transgenik fare eldesi açı sından karşılaştınldığmda aradaki farkın istatiksel açıdan önemli olmadığı belirlendi (P>0.05). Enjeksiyon yapılmış embriyolardan yavru elde edilmesi nedeni ile mikroenjeksiyon tekniğinin ve embriyo transferinin optimize olduğu söylenebilir. İleride yürütülecek çalışmalarla da elde edilecek optimizasyonundan sonra, sığır, koyun, keçi ve domuz gibi hay vanların embriyolarına gen transferi yaparak transgenik çiftlik hayvanlan elde edile bileceği ülkemiz için de düşünülmektedir.

The main objective of the thesis was to obtain transgenic mice by using two diff erent gene constructs. The experimental strategy consisted of 5 main steps which were summarized as, superovulation of the mice, embryo collection from the superovulated mice, gene transfer to the collected embryos via microenjection, the implantation of the embryos into the oviduct of recipients, and the control of the newborn mice with trans genic analysis procedures. In total 184 female mice (CB6 Fj hybrid) were used. The number of the donor female mice was 146. 38 mice were used as recipient mothers. For the syncronization of the recipient mothers, 30 vasectomized male mice of the same strain were used. In the study, the superovulation was obtained with PMSG and hCG with a con centration of 5 IU. The gene contracts, pXGH5 and p53-248, were microinjected into the male pronuclei of the collected zygotes, and then these microinjected zygotes (about 20-25) were transferred into the oviduct of the recipient mother. The new born trans genic mice were checked by a dot-blot hybridization protocol. The results of the two experiment can be summarized as follows: In the first group, 1470 zygote were obtained and 1269 (86.32%) were micro- injected with the pXGH5 gene of these zygotes 769 (60.59%) proved to be alive after the injection. And 420 of them were transfered into the recipient mothers (54.61%). As a result, 70 off-springs were obtained. Out of these 3 (4.28%) proved to be transgenic. In the second group, 1246 zygotes were obtained and 1020 (81.86%) of them were microinjected with the p53-248 gene. 601 zygotes (58.92%) proved to be alive after the injection. And 400 (66.55%) of them were transfered to the recipient mothers. 105 (26.25%) off-springs were obtained. Out of these 6 (5.71%) proved to be transgenic.72 All statistical data were discussed using the Chi-square test. No significant statistic relationship between the numbers of the live zygotes used in the two experiments could be found (P>0.05). When the birth ratios of the two group's were compared, a statistically significant value (P< 0.001) was found for the p-53- 248 gene. While comparison of the first group's birth rates with the control group sho wed a significant drop, no such difference was found for the second group. Comparision of the ratio of transgenic mice in both groups of showed no significant difference (P>0.05). According to the data obtained, the transgenic mice production was optimized. And in the future we think that this technique will help us in the production of live stock like cows, sheep, goats and pigs which are important for Turkish farmers.