Balgam ve plevral sıvı örneklerinde Mycobacterium Tuberculosis`in polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile saptanması

Abstract

VII. ÖZET Tüberküloz enfeksiyonlarının teşhisi her zaman önemli bir problem oluşturmuştur. Bu enfeksiyonların engellenmesindeki majör eksikliklerden biöri etyolojik ajanın, yani Mycobacterium tuberculosis'in etkin kontrolü için gerekli, hızlı ve kesin sonuç verebilecek bir teşhis yönteminin olmamasından kaynaklanmaktadır. Pratik olarak klinikte mycobacteryel enfeksiyonların teşhisi üç şekilde yapılmaktadır. Ancak bunların hepsinin kendine özgü avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Bu amaçla geliştirilen DNA analiz yöntemine göre, basil DNA'sı polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılarak, Southern blot yöntemiyle filtreye aktarılmakta ve radyoaktif prob ile hibridizasyona sokularak, Mycobacterium tuberculosis DNA'sının varlığı saptanmaktadır. Çalışmamızın amacı, DNA amplifikasyon yöntemini teşhiste hassasiyet, özgünlük ve çabukluk açısından diğer yöntemlerle kıyaslamaktır. Kontrol amacıyla kullandığımız ve radyolojik olarak akciğer tüberkülozlu olan 14 hastanın balgam örneği mikroskopik incelemelerde pozitif sonuç verirken, ancak % 50'si kültürde pozitif sonuç vermiştir. Bunun yanısıra yapılan DNA analiz yöntemi sonucunda örneklerin tamamında pozitif sonuç elde edilmiştir. Tüberküloz plörezili, maligniteii ve kronik kalp yetmezliği olan ve ancak akciğer biopsisi yapıldığında pozitif sonuç elde edilebilen hastaların plevral sıvıları incelendiğinde, örneklerin tamamı kültürde negatif sonuç verirken, biri hariç tümü mikroskopik incelemede negatif sonuç vermiştir. DNA analiz yöntemi sonucunda ise tüm plevra örneklerinin % 69.4'ü pozitif, % 30.6'sı negatif sonuç verirken; tüberküloz plörezili yakaların % 91.1'i pozitif, % 8.9'u negatif sonuç vermiştir. Bu çalışmalarımızın sonucunda, polimeraz zincir reaksiyonunun plevra örneklerindeki hassasiyeti %82.7 olarak bulunurken, özgünlüğü %100 olarak tesbit edilmiştir. Balgam örneklerinde ise %100 hassasiyet ve özgünlük saptanmıştır. Sonuç olarak; polimeraz zincir reaksiyonu ile özellikle balgam örneği elde edilemeyen akciğer dışı organ tüberkülozlu vakalardan alınan, plevral sıvı gibi, çok az miktarda bakteri içeren klinik örneklerde; kısa zamanda, hassas ve özgün bir şekilde Mycobacterium tuberculosis'in varlığını saptamak mümkün olmaktadır. 61

VIII. SUMMARY The diagnosis of mycobacterial infections remains an important medical problem. The major problem in diagnosis of mycobacterium tuberculosis is the absence of a rapid, sensitive and specific method. Three approaches are used in clinical practice to identify patients with mycobacterial infections. Although each has a distinct advantages and limitations. More recently, some investigators have developed techniques for the detection of mycobacterial DNA in clinical samples using techniques based on polymerase chain reaction. According to this method a DNA sequence amplified by utilizing primers specific to mycobacteria, electrophoresed on agarose gel and transferred to nylon filter by Southern blot and detected the presence of this amplified sequence by hybridization with a radioactively labelled probe specific to Mycobacterium tuberculosis. The purpose of our study, comparing the results obtained by DNA amplification with results obtained by traditional microbiological techniques. Our control group was the sputum of 14 tuberculosis patients. The diagnosis of tuberculosis was made on the basis of radiological, microscopic examination and clinical results. 50% these samples was positive. We showed that all of these samples was M. tuberculosis positive by DNA analysis. In this study, we attempt to identify M. tuberculosis in pleural fluid from patients with tuberculous pleurisy, malignity and chronic cardiac deficiency. Mycobacteria could be detected by culture in none and by acid fast staining in one of these pleural fluid samples. Our protocol based on DNA analysis gave positive result in 69.4 % and negative result in 30.6 %. On the other hand patients with tuberculous pleurisy gave 91.1 % positive, 8.9 % negative result. Our findings also indicate that the sensitivity of PCR with pleural fluid is 82.7 % and specificity is 100 %. The sensitivity and specificity of this method is 1 00 % with sputum samples. In conclusion, a method for gene amplification of Mycobacterium tuberculosis DNA by PCR is sensitive and specific enough for clinical use in patients have extrapulmonary tuberculosis whose sputum or clinical samples contains as little as a single copy of Mycobacterium tuberculosis. 62