Tip 1 diabetli hasta serumlarından High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yöntemiyle immünoglobulinlerin saflaştırılması

Abstract

68 ÖZET Bo çalışmada serum örneklerinden total IgG saflaştırılması, HPLC yöntemiyle miktar ayini ve yine HPLC'de affinite kromatografisi ile, IgG alt gruplarının fraksiyonlandırılmasım akiben IgGl,kappa ve IgGl,lambda'nm miktar tayinleri üzerinde durulmuş; tespit edilen julgular, hasta gruplarının diabetik özellikleri açısından incelenmiştir. Çalışmanın ilk ışamasmda, IgG saflaştırma metodunun seçimi için a) Etanol ilavesi ile b) kaprilik asit- amonyum sülfat ilavesi ile çöktürme teknikleri ayrı ayrı denenmiş ve elde edilen total IgG pelletlerinin saflıkları agaroz jel elektroforezi ve HPLC'de jel filtrasyon kromatografisi ile kontrol edilmiştir. Kaprilik asit-amonyum sülfat ilavesi ile çöktürme tekniğinin etkinliğinin belirlenmesinden sonra, Tip 1 diabetli preklinik dönemde 7 hasta, erken klinik dönemde 9 hasta ve geç klinik dönemde olan 13 hastanın ve ayrıca 7 kişiden oluşan kontrol bireylerin serum örneklerinden saflaştmlan total IgG seviyeleri, yine bu çalışma için geliştirilen HPLC jel filtrasyon kromatografisi yöntemiyle tayin edilmiştir. Ayrıca HPLC'de affinite kromatografisi yönteminin tarafımızdan geliştirilen bir pH gradienti elüsyonu tekniği ile, IgG alt grupları fraksiyonlandırılmış, IgGl,kappa ve IgGl,lambda'mn miktar tayinleri yapılmıştır. Tüm hasta ve kontrol gruplarına ait bireylerde ICA ve IAA/A1A tayinleri yapılmıştır. Tip 1 diabetli bireylerin ve kontrol bireylerin serum total IgG seviyeleri karşılaştırıldığında, her üç hasta grubuna ait total IgG bulguları, kontrol grubuna göre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. Buna paralel olarak hasta serum IgGl.kappa seviyelerinin de kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek olduğu anlaşılmıştır.69 Sonuç olarak, saflaştırılmış IgG ve IgGl,kappa'nın henüz diabetin klinik ve laboratuvar larak fonksiyon bozukluğu göstermediği preklinik dönemde, uygun bir belirteç olabileceği, yrıca Tıp 1 diabetin klinik döneminde otoimmün aktivasyonun güvenilir bir göstergesi olarak ullanılabileceğini söylemek mümkündür.

70 SUMMARY In this study it has been empasized on purification of total IgG from serum samples, and jantitative assay by HPLC method and also quantitation of IgGl.kappa and IgGl,lambda )llowing fractionation of subgrups of IgG by HPLC affinity chromatography and results were ompared according to diabetic findings of patients in different stages of Type 1 diabetes. In ıe first step of the study, with the aim of the method selection for purification of IgG ifferent precipitation technics by addition of a)ethanol, and b) caprylic acid-ammonium ulphate were tested separately,and purification of total IgG pellets were controlled by both garose gel electrophoresis and HPLC gel filtration chromatography. After assessment of efficiency of the precipitation technic by caprylic acid-ammonium ;ulphate addition, total IgG levels purified from serum samples of seven patients with preclinic jeriod, nine with early clinical period and thirteen with late clinical period of Type 1 diabetes md samples of seven healthy - control individuals were determined by HPLC gel filtration chromatography method which was developed particularly for this study. Moreover, Quantitative assays of IgGl,kappa and IgGl, lambda were performed following fractionation Df IgG subgroups by HPLC affinity chromatography method using our modified pH gradient ;lution technic. ICA and IAA/AIA assays were performed in individuals of Type 1 diabetes and control groups. Comparison of scrum total IgG levels in patients with Type 1 diabetes and control individuals showed that mean total IgG lcvels'in all three groups of Type 1 diabetes patients were significantly higher than control individuals. Mean scrum levels of IgGl, kappa in all patients groups were also found to be markedly increased than control values.71 As a conclusion, it is possible to say that, purified IgG and IgGl,kappa levels could be pproprate markers in preclinic stages of Type 1 diabetes, before definement of any onsiderable clinical and/or laboratory functional impairment, and moreover this levels could e used as a reliable index of autoimmune activation during clinical stages of Type 1 diabetes.