Gastrik asit sekresyonu inhibisyonunun gastrin ve somatostatin hücreleri üzerindeki etkisinin nonradyoaktif in situ hibridizasyon ve immunohistokimyasal yöntemlerle incelenmesi

Abstract

67 6. ÖZET Gastrin ve somatostatin gastrointestinal kanalda önemli rolleri olan iki güçlü regülatör peptiddir. Mide somatostatin ve gastrin hücreleri üzerine mide asidinin etkisini gösteren çeşitli çalışmalar arasında tam bir fikir birliği bulunmamaktadır. Bu nedenle çalışmada omeprazol ile asid sekresyonu inhibe edilen sıçanların pilor mukozasında, gastrin ve somatostatin hücrelerinde meydana gelen değişiklikler; RIA ile serum gastrin seviyesi, nonradyoaktif in situ hibridizasyon ile mRNA, immunohistokimya ve ultrastrüktürel immünositokimya ile peptid düzeyinde araştırılması amaçlandı. Sprague-Dawley tipi 200-250 g ağırlığında,48 adet, dişi sıçan kullanıldı. Deney hayvanları üç gruba ayrıldı. 1. grup: kontrol grubu olarak iki alt grup halinde düzenlendi (16 hayvan). 2. grup: 20mg/kg/gün omeprazol verilen sıçanlar uygulama sürelerine bağlı olarak iki alt gruba ayrıldı (16 hayvan). Dört gün süre ile omeprazol uygulanan grup (8 hayvan) ve iki ay süre ile omeprazol uygulanan grup (8hayvan). 3. grup: 100mg/kg/gün omeprazol verilen sıçanlar iki farklı süre için iki alt gruba ayrıldı (16 hayvan). Dört gün süre ile omeprazol uygulanan (8hayvan) ve iki ay süre ile omeprazol uygulanan grup (8hayvan). Deney süreleri sonunda tüm sıçanlardan, eter anestezisi altında iken gastrin ölçümü için kan örnekleri alındı ve mide pilor bölgeleri çıkarıldı. Doku örnekleri paraformaldehyde fikse edilip, parafine gömüldü. Omeprazol verilen tüm deney gruplarında serum gastrin seviyeleri kontrollere göre istatistiksel olarak anlamlı bir artış gösterdi (Kontrol <20mg/kg <100mg/kg). Omeprazol verilen gruplara ait pilor mukozası immunreaktif gastrin hücre sayısında ve immunreaksıyon şiddetinde kontrollere göre artış saptandı. Bu artış 20mg/kg dört gün omeprazol verilen grupta istatistiksel olarak anlamlı olmayıp diğer tüm gruplarda ise ileri düzeyde ( p<0.001) anlamlı idi. Kontrol grubuna ait preparatlarda immunreaktif gastrin hücreleri pilor bezlerinin dip kısımlarında dağınık olarak tek tek yerleşmişlerdi. Deney gruplarında ise immun pozitif gastrin hücreleri pilor bezlerinin dip kısımlarında daha yoğun olmakla birlikte tüm mukozada dağınık olarak gözlendi. İn situ hibridizasyon yöntemi ile hazırlanmış pilor parafin kesitlerinde digoxigenin68 işaretli sıçan gastrin probu kullanılarak gastrin mRNA sinyalleri gösterildi. Kontrol ve tüm deney grupları pilor kesitlerinde gastrin mRNA sinyali içeren hücrelerin genellikle pilor bezlerin üst kısımlarında yer aldıkları gözlendi. Gastrin mRNA sinyalleri genellikle hücrenin tüm siîoplazmasında bazen de bazolateral kısmında yerleşmişdi. İmmunogold yöntemi uygulanan deney gruplarında gastrin hücreleri, kontrollere kıyasla gastrin sentez ve sekresyonunun arttığını destekleyen ultrastrüktüreî özelliklere sahip olarak gözlendi. İmmunreaktif somatostatin hücre sayısında kısa süreli uygulamada kullanılmış olan farklı doz gruplarında ve iki ay süre ile 100mg/kg omeprazol verilen deney grubunda kontrole kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (p>0.05). Deney grupları içinde sadece 20mg/kg iki ay omeprazol verilen grupda somatostatin immun pozitif hücre sayısında artış gözlendi (p<0.001). İmmun pozitif somatostatin hücrelerine pilor bezlerinin 1/3 lük bazal kısmında daha fazla olmak üzere üst kısımlarda tek tek rastlandı. İmmunreaktif materyalin somatostatin hücrelerin genellikle bazolateral bölgesinde ve bazal uzantılarda yer aldığı gözlendi. Digoxigenin işaretli somatostatin probu kullanılarak pilor parafin kesitlerinde ilk defa olarak somatostatin mRNA sinyali tesbit edildi. Somatostatin mRNA sinyalleri içeren hücrelerin genellikle pilor bezlerin dip kısımlarında yer aldığı gözlendi. Somatostatin mRNA sinyalleri genellikle hücrelerin bazolateral bölgesinde görüldü. Omeprazol verilen sıçanların somatostatin mRNA ve peptid dağılımında kontrollere göre önemli bir fark bulunmadı. Sonuç olarak digoxigenin işaretli prob kullanarak uygulanan nonradyoaktif in situ hibridizasyon yöntemi, mide mukozasında basit ve hızlı olarak her iki mRNA içeriğinin lokalizasyonunu göstermeyi sağlamıştır. Omeprazol ile mide asid inhibisyonunun, sıçan pilor mukozasının G hücre sayısında kontrole göre belirgin bir artışa neden olduğu, D hücre sayısında ise önemli bir değişiklik oluşturmadığı saptandı. Bu bulgular ile aklorhidri ortamında, gastrin ve somatostatinin resiprokal olarak etkilenmediği sonucuna varıldı.

69 7. SUMMARY Gastrin and somatostatin are two potent regulatory peptides having important roles in gastrointestinal tract. There isn't a common thought on the effect of gastric acid on gastrin and somatostatin cells in stomach among various studies. For this reason, in the study it was aimed to investigate the alterations in gastrin and somatostatin cells of rat pyloric mucosa which has an omeprazole-inhibited acid secretion; by determination of serum gastrin level with RIA, by nonradioactive in situ hybridization at mRNA level and by immunohistochemistry and ultrastructural immunocytochemistry at peptide level. 48 female Sprague-Dawley rats weighing 200-250 g were used. Experimental animals were divided into 3 groups. 1. group : it was designed as control group under two subgroups (16 rats). 2. group : rats treated with 20mg/kg/day omeprazole were divided into two subgroups due to the administration periods (16 rats); omeprazole treated groups for a period of four days (8rats) and for a period of two months (8 rats). 3. group : rats treated with 100mg/kg/day omeprazole were divided into two subgroups for two different treatment periods (16 rats); groups treated with omeprazole for four days ( 8 rats) and for two months (8 rats). At the end of the experimental period, blood samples were taken from rats under ether anesthesia for gastrin measurement and pylor of the stomach were dissected. Tissue samples were fixed in paraformaldehyde and embedded in paraffin. Serum gastrin levels in all groups treated with omeprazole showed a statistically significant increase compared to controls ( controls <20mg/kg < 100mg/kg). An increase in the number of immunoreactive gastrin cells in pyloric mucosa and an enhancement in intensity of immunoreaction were determined in omeprazole treated groups. While this increase wasn't statistically significant in 20mg/kg for four days treated group, it was highly significant (p<0.001) in all the other groups. Immunoreactive gastrin cells of control group were scattered one by one at the base of pyloric glands. On the7() other hand immunopositive gastrin cells were scattered all through the mucosa particularly at the base of pyloric glands in experimental group. Gastrin mRNA signals in pyloric paraffin sections were visualized by in situ hybridization using digoxigenin labelled rat gastrin probe. Cells containing gastrin mRNA signal were observed to locate in the upper regions of pyloric glands in pyloric sections of control and all experimental groups. Gastrin mRNA signals were generally localized in the whole cytoplasm but sometimes they were in the basolateral region. Gastrin cells were observed to have ultrastructural properties supporting the increase in gastrin synthesis and secretion compared to controls. A statistically significant difference in immunoreactive somatostatin cell number couldn't be found in the different dosage groups treated for short periods and treated with 100mg/kg omeprazole for two months when compared to controls (p>0.05). There was an increase in somatostatin immunopositive cell number only in for two months 20mg/kg omeprazole treated group(p<0.001). Immunopositive somatostatin cells were found in the upper regions particularly more in the 1/3 basal region of pyloric glands. Immunoreactive materials were observed to localize generally in basolateral regions and basal process of somatostatin cells. Somatostatin mRNA signals were determined in paraffin sections from pylor for the first time by using digoxigenin labelled somatostatin probe. Cells containing somatostatin mRNA signals were found generally in the base parts of the pyloric glands. Somatostatin mRNA signals were often observed in basolateral regions of the cells. There wasn't a marked difference in somatostatin mRNA and distribution of peptide in omeprazole treated rats compared to controls. As a conclusion, nonradioactive in situ hybridization method performed by digoxigenin labelled probe, has allowed showing both mRNA contents in gastric mucosa easily and rapidly. Gastric acid inhibition by omeprazole was determined to cause a marked increase in G cell number compared to control and not to result in a significant change in D cell number. These findings suggest that gastrin and somatostatin aren't affected resiprocally in achlorhydric conditions.