Muskarinik reseptör alt tiplerinde İmperialin` in antagonistik etkisinin in vitro araştırılması

Abstract

6. ÖZET 1914 yılında Sir Henry Dale, bazı kolin esterlerinin `Nicotiana tabacum` bitkilerinden elde edilen `nikotin` ve `Amanita muskaria` mantarlarından elde edilen `muskarin` maddelerine benzer etkiler gösterdiğini ortaya çıkardıktan ve de otonom sinir sistemindeki nörotransmitterlerden birinin Asetilkolin olduğunu açıkladıktan sonra, asetilkolinin iki şekilde etki ortaya çıkardığını saptamış ve bunları benzerliklerinden dolayı asetilkolinin `nikotinik etkisi` ve `muskarinik etkisi` diye tanımlamıştır. Daha sonraları tübokürarin ve atropinin, asetilkolinin nikotinik ve muskarinik etkilerini bloke etme kapasitelerindeki farklılığı, kolinerjik reseptörlerin iki gruba ayrılmalarını sağlamış ve muskarinik etkilerin ortaya çıkarılmasını sağlayan reseptör grubuna `muskarinik reseptörler` denilmiştir. Muskarinik reseptörlerin aslmda homojen olmadığı ve kendi arasında alt gruplara ayrılabileceği düşüncesi gallaminin, metakolinin oluşturduğu negatif kronotropiyi azalttığı konsantrasyonlarda kan basmcmda hiç bir azalma yapmamasıyla ortaya atılmıştır. Heterojeniteye ipucu olan bir diğer olay ise McN-A 343 'ün sempatik ganglionda atropine hassas stimulator etki yapmasma rağmen, kalpte ve jejenumda etkisiz olduğunun gösterilmesiydi. Ancak en önemli adım Hammer ve arkadaşları tarafından 1980 yılında yapılan bir çalışmada peptik ülser tedavisinde kullanılan pirenzepinin nöronal hücrelerdeki muskarinik reseptörlere afmitesinin periferdekilere oranla belirgin derecede farklılık göstermesinin bulunmasıyla atılmıştır. 1982'de Hammer ve Giachetti, pirenzepin ve McN-A 343'ün aynı reseptör tipine afmite gösterdiklerini kanıtladıktan sonra, muskarinik reseptörler pirenzepine afinitesi yüksek olanlar Mı, düşük olanlar M2 diye alt gruplara ayrılmıştır. Daha sonra yapılan çalışmalarda ise kalpteki muskarinik reseptörlerin damar düz kaslarında ve gastro-intestinal sistemdekilerden farklı olduğu ve AF-DX 116, metoktramin, gallamin gibi maddelerin daha çok kalptekilere; heksahidrosiladifenidol ve bunun para-fluoro türevinin ise ileumdakilere daha fazla afinite duyduğu gösterilmiştir. Buna göre de kalpteki muskarinik reseptörlere M2, düz kaslardakilere ise M3 denilmiştir. Bulunan çeşitli antagonistlerin organizmanın değişik bölgelerinde değişik afmite göstermelerinin yanı sıra moleküler gen tekniğiningelişmesi sayesinde reseptörlerdeki amino asit sıralamasının belirlenmesiyle, muskarinik reseptörlerdeki heterojenite bir ölçüde aydınlatılmıştır. Moleküler klonlama ve radyoligand bağlama çalışmalarıyla en son olarak beş değişik muskarinik reseptör alt-grubu bulunduğu belirtilmektedir (ml-m5). Fonksiyonel Mı, M2, M3 ve Melerin sırasıyla moleküler biolojik teknikler vasıtasıyla elde edilen mi, m2, m3 ve m4'lere eşdeğer oluğu saptanmıştır. Ancak daha henüz m5'e eşdeğer fonksiyonel bir reseptör tespit edilememiştir. Muskarinik reseptörler, G-proteine bağlanmak suretiyle etki gösteren reseptörler grubuna aittir. Amino asit zincirinin hidrofobik yapıda ve a-heliks şeklinde olduğu 7-transmembran (TM1-TM7) bölgeden geçtiği ve bu transmembran bölgelerinin de ekstraselüler ve intraselüler olarak üçer yerden bağlandığı; ilk amino grubunun hücre dışında ve son karboksi grubunun hücre içinde olduğu proteinlerdir. Muskarinik reseptörlerin beş alt tipinin de yapı olarak birbirlerine benzemesi ve transmembran bölgelerinin aynı olmasıyla birlikte, amino ve karboksi terminallerinin ve de en önemlisi İ3 intraselüler luptaki değişiklikleri ile farklı etkiler göstermektedirler. İ3 lupunda daha fazla benzerlik olanlar sinyal iletiminde aynı yolu takip etmektedirler: yani mi, m3 ve m5 reseptörleri fosfoinositol hidrolizi stimüle ederken m2 ve m4 reseptörleri adenilil siklaz aktivitesini azaltmaktadırlar. Muskarinik reseptörlerdeki heterojenitenin aydınlatılması, pirenzepine afinitesi yüksek olanları Mı; metoktramin, gallamin ve AF- DX 116'ya afinitesi yüksek olanları M2 ve p-f-HHSiD'e afinitesi yüksek olanları M3 diye göstermekle mümkün olabileceği düşünülmekteydi. Tabii bu arada M4-alt tipinin M2-alt tipine yapısal olarak benzerlik göstermesi nedeniyle de M2-selektif antagonistlerin aynı zamanda M^e de yüksek afınitede olabileceği varsayılmaktadır. Ancak şu anda kullanılan antagonistlerin alt tipler arasında çok fazla seçicilik gösterememesi hem de pirenzepinin Mı'lerin yanı sıra Melere de afınitesinin fazla olduğunun bulunması nedeniyle bu şekilde bir ayırımın da yeterli olmadığı anlaşılmaktadır. Bu yüzden şu andaki en etkin çözümün bir çok antagonistin bir çok reseptör modeli üzerinde (belli bir reseptör alt tipini ihtiva ettiği varsayılan preparatlarda) afınitelerinin hesaplanıp, buna göre bir ayırım yapılması olduğu düşünülmektedir.Bu çalışmadaki amacımız İmperialinin 5 ayrı preparat üzerindeki afınitesini saptayarak tavşan vas deferens, sıçan duodenum ve kobay safra kesesindeki muskarinik reseptör alt tipleri arasında bir ayırım yapmaya çalışmaktı. İmperialin, Fritillaria türlerinden (özellikle Fritillaria imperıalis) elde edilen steroidal yapılı bir alkaloiddir. İmperialinin izole düz kaslarda asetilkolinin etkisini bloke ettiği çok önceden bildirilmiş ancak 1992 yılında Eğlen ve arkadaşlarının bir makalesinde M2-seçici olduğu fakat M4 ile Meleri pek ayırdedemediği bildirilmiştir. Aynı çalışmada Himbasin ile birlikte Mı ve M4!ü ayırabilecek iyi bir ajan olabileceği belirtilmektedir. Bizim bu çalışmamızda da sıçan sol atriumu ve kobay ileumu standart model olarak kullanarak, tavşan vas deferens, kobay safra kesesi ve sıçan duodenumdaki muskarinik reseptör alt tiplerini imperialine olan afmitelerine göre ayırmayı amaçladık. Yaptığımız deneylerde, imperialin agonistlerin konsantrasyon-cevap eğrilerini maksimum etkinliklerini değiştirmeden konsantrasyona bağımlı olarak paralel bir şekilde sağa kaydırdı. Schild grafiklerinden pA2 değerleri TVD için 7.3, SD için 6.64, SSA için 7.44, Kİ için 6.62 ve KSK için ise 7.14 olarak hesaplandı. Sonuç: Pirenzepine olan yüksek afınitesinden dolayı tavşan vas deferensinde ATP salınımını azaltan presinaptik Mı reseptörler olduğu varsayılmış. Yine aynı şekilde sıçan duodenumunda da nonadrenerjik- nonkolinerjik nöronlarda da relaksasyonu sağlayan Mı reseptörlerin varlığından bahsedilmiştir. Ancak biraz önce de belirtildiği gibi pirenzepinin Mı ve Meleri iyi ayıramadığı, Mı'leri M4'ten ayırabilmek için Himbasinin daha etkili olduğu gösterilmiş ve Sagrada'nın bir çalışmasında da himbasine yüksek afmitesine dayanarak tavşan vas deferensinde Mı değil de M4 olduğu ileri sürülmüştür. Birkaç değişik antagonistin afmitelerine göre kobay safra kesesinde M4 olduğu söylenmiş ancak bir başka çalışmada ise silaheksasikliumun afmitesine dayanarak safra kesesinde M4 yerine M3 olduğu ifade edilmiştir. İmperialin ile aldığımız sonuçlarda en çok göze batan tavşan vas deferens ile sıçan duodenumun afinitelerinin birbirinden çok farklı olduğudur. Tavşan vas deferens sıçan atriuma çok yakın bir pA2 değerigösterirken, sıçan duodenum ise daha çok ileuma yakın bir değerdedir. Eglen'in çalışmasına bakılınca da Mı modeli olarak kullanılan safen veni ile de çok uyumlu olduğu gözükmektedir. Bu değerlerin ışığı altında ve ayrıca da himbasinin etkilerini de dikkate alacak olursak sıçan duodenumda relaksasyondan sorumlu reseptörlerin Mı olduğunu, vas deferenste ATP salınımını inhibe eden reseptörlerin ise M4 olduğunu söylemek mümkündür. İmperialin değerlerine bakarak safra kesesi için kesin bir şey söylemek mümkün değil, çünkü pA2 değeri sıçan atrium ile kobay ileum arasında. Ancak bu preparatm kasılmasında hem fosfotidil inositol hidrolizinin hem de cAMP düzeyinin azalmasını göz önüne alırsak, kasılmada hem M4 hem de M3 reseptörlerinin rol oynadığını söyleyebiliriz. Ancak kasılmanın hangi yoldan oluştuğunu daha iyi açıklayabilmek için daha seçici antagonistlerin bulunması ve/veya daha fazla sayıda antagonistin bir kaç M4 ve M3 modelleriyle birlikte safra kesesinde denenmesi gerekmektedir.

7. SUMMARY In 1914, after Sir Henry Dale discovered that some choline esters displayed activities similar to nicotine obtained from Nicotiana tabacum and muscarine obtained from Amanita muscaria and after the discovery of acetylcholine to be one of the neurotransmitters in the autonomic nervous system, Dale found out that Ach acted in two different ways and because of the similarities in its activity, he referred to them as the `nicotinic` and `muscarinic` effects of Ach. Afterwards, the difference in the ability of tubocurarine and atropine to block the nicotinic and muscarinic effects of Ach, respectively, led to the differentiation of cholinergic receptors to two groups and the group to mediate the muscarine-like effects of Ach was termed muscarinic receptors. The first hint to the heterogeneity in muscarinic receptors was the observation of Riker and Wescoe who reported that gallamine inhibited two effects of metacholine with different intensity: the negative chronotropy was diminished at a dosage that did not affect the decrease of blood pressure caused by metacholine. Another hint was the observation that McN-A 343 produced atropine sensitive pressure effect by stimulation of excitatory muscarinic receptors in the sympathetic ganglia while on the other hand the muscarinic receptors of the heart and jejenum were not affected. However, the breakthrough in the classification of muscarinic receptors was the investigation of Hammer et al. who demonstrated that an agent used in the treatment of peptic ulcer, pirenzepine, displayed distinct higher affinity to muscarinic receptors of neuronal tissues than to peripheral muscarinic receptors. In 1982, when Hammer and Giachetti showed that the high affinity binding sites of pirenzepine and McN-A 343 represented a common receptor subtype, muscarinic subtypes were designated with high affinity for pirenzepine as Mi and those with low affinity as M2 receptors. The studies undertaken afterwards displayed the fact that muscarinic receptors of the heart were different from the ones of the gastrointestinal tract and substances such as AF-DX 116, methoctramine and gallamine had higher affinity for those of the heart and hexohydrasiladifenidol and its para-fluoro derivative displayed more affinity to those of the ileum.S7 Accordingly, muscarinic receptors of the heart and smooth muscles were termed M2 and M3, respectively. Along with the affinity profile of various antagonists established in different parts of the organism, the heterogeneity in muscarinic receptors was delineated by the determination of the amino acid sequence with the aid of molecular gene technology. Molecular cloning and radioligand binding studies' results show that at least five different muscarinic receptor subtypes are present (ml-m5). A good correlation of the functional Mi, M2, M3 and M4 subtypes to ml, m2, m3 and m4 genes, respectively, has been shown to exist, however, until to date no functional role of the m5 gene product has been identified. Muscarinic receptors belong to the superfamily of G-protein coupled receptors. They are huge proteins in which the amino acid chain forms 7 transmembrane spanning regions and these regions are bound with 3 external and 3 internal hydrophyllic loops. While the structure and the transmembrane regions of five muscarinic subtypes resemble each other, differences in the amino and carboxyl terminals and most importantly in the İ3 intracellular loop enables different activities within subtypes. Subtypes having more similarity in the İ3 loop show similar effects in signal transduction, i.e. while ml, m3 and m5 receptors stimulate phosphoinositole turnover, m2 and m4 receptors inhibit adenylyl cyclase activity. It was thought that the heterogeneity could be resolved by designating Mi as those with high affinity to pirenzepine, M2 as those with high affinity to AF-DX 116, methoctramine and gallamine and M3 as those with high affinity to para-fluoro-hexahydrosiladifenidol. Also it was accepted that due to structural similarity between M2 and M4 subtypes, M2-selective antagonists displayed high affinity to M4 receptors. However the fact that antagonists used today cannot clearly distinguish between subtypes and also the affinity of pirenzepine to M4 subtype being very close to Mi makes it evident that a discrimination as described above may not be sufficient. A better solution to this problem is the foundation of affinity profiles of many antagonists on many different receptor models and making a comparison accordingly.£fci In this study we aimed to differentiate the muscarinic receptor subtypes responsible for inhibition of neurogenic twitch contractions in rabbit vas deferens, relaxations of rat duodenum and contractions of guinea-pig gallbladder by the use of the affinity profile of Imperialine. Imperialine (IMP) is a steroidal alkaloid isolated from species of Fritillaria (especially Fritillaria imperialis). It has been shown to block the effects of Ach in isolated smooth muscles a long time ago, however a more detailed study has been made in 1992 by Eğlen et al. who discovered that it differentiated between M2 and M1/M3 subtypes but it displayed the same affinity for M2 and 1114 sites according to radioligand binding studies. On the same article it was indicated that IMP, together with himbacine, could be used to discriminate Mi from M4 subtypes. In our study we tried to delineate the muscarinic receptor subtypes in rabbit vas deferens (RVD), rat duodenum (RD) and guinea-pig gallbladder (GGB) by using rat left atrium (RLA) and guinea-pig ileum (GI) as standart models. IMP shifted the concentration-response curves of the muscarinic agonists used concentration-dependantly and by having no effect on the maximum responses. pA2 values calculated from regression lines of the Schild-Plots are 7.3, 6.64, 7.44, 6.62 and 7.14 for RVD, RD, RLA, GI and GGB, respectively. Conclusions: RVD was claimed to possess presynaptic Mi receptors inhibiting ATP release according to its high affinity to pirenzepine. Also relaxations of RD were revealed to be produced by the soma-dendritic Mi muscarinic receptors at nonadrenergic-noncholinergic neurons. However recent evidence denotes that pirenzepine does not discriminate Mi from M4 subtypes and thus assessing that a particular tissue possesses Mi receptors by only relying on its high affinity to pirenzepine would be erroneous. Himbacine has been shown to be the most important tool to discriminate Mi receptors from M4 and in a work of Sagrada et al. depending on its high affinity to himbacine, inhibition of neurogenic twitch contractions in RVD was assumed to be mediated by M4 receptors. Muscarinic receptor subtypes responsible for the contraction on GGB were assessed to be of the Mi-type by the use of several subtype- preferring antagonists. However this has been disputed and M3 muscarinicreceptors have been assumed to play the major role for contraction of this tissue by relying on the affinity of silahexocyclium. The most evident observation in our work is the fact that RVD and RD have different affinities to IMP. This provides clear evidence that the muscarinic receptors responsible for the effects of these tissues are not of the same type. The pA2 value of IMP on RVD is very close to that of RLA and the pA£ value of RD is very close to that of GI and also is in good agreement with the dog saphenous vein showing that RVD and RD possess M4 and Mi, respectively. Nothing can distinctly be stated about the subtype involved in the contraction of GGB as this preparation reveals intermediate affinity for IMP. However taking into consideration the contributions of both phosphoinositole turnover and cAMP inhibition during the contraction of GGB strips, it can be proposed that both M3 and M4 subtypes are responsible for these effects. In order to clarify this issue, more selective antagonists are needed and/or more investigations with different antagonists on M4, M3 models should be carried out together with GGB.