İn vitro fertilizasyon yöntemi ile elde edilen fare embriyolarının gelişimine farklı potasyum konsantrasyonlarının etkileri

Abstract

8. ÖZET Çalışmada, saf fare ırklarında in vitro fertilizasyon ve kültür ortamlarında şekillenen 2 blastomerli hücre bloğunun aşılması amacı ile, farklı KH2PO4 (0.0081 g/100 ml_, 0.00162 g/100 ml_, 0.0324 g/î 00 ml_) oranları içeren, Whitten's medyumlarında kültüre ve ko-kültüre edilen embriyoların gelişimleri değerlendirildi. Bu amaçla BALB/C ırkı 74 adet dişi ve 16 adet erkek fare kullanıldı. Süperovulasyon amacıyla, 5 LU PMSG enjeksiyonu ve bunu takiben 48 saat sonra 5 LU hCG enjeksiyonu uygulandı. Süperovule edilen farelerden elde edilen 1191 adet oositten 1071 tanesi, epididimisten kazanılan ve 1,5-2 saat süreyle TYH medyumunda kapasite edilen sperma ile 4-6 saat süreyle fertilize edildiler. Fertilize olan oositler düşük, normal (kontrol), yüksek oranda potasyum içeren ovidukt epitel hücreleri ile birlikte veya bu hücreler olmaksızın 96 saat süreyle kültüre edildiler. Kültüre edilen embriyoların gelişimleri her 24 saatte bir kontrol edilerek kaydedildi. Kültürün 24. saatinde, yarıklanma oranları bakımından gruplar arasında şekillenen farklar istatistiki açıdan önemli bulunmadı. Yine bu sürenin sonunda tüm gruplarda embriyolar 2-6 blastomerli safhada yoğunlaştı. Kültürün 48. saati sonunda tüm gruplarda cleavage oranlarının arttığı ve artışın ko-kültüre edilen gruplarda, kültüre edilen gruplara göre daha fazla olduğu saptandı, ilk 48 saatin sonunda gruplarda yarıklanma oranları sırasıyla, düşük K+ % 60.00, düşük K++ko-kültür % 68.71, normal K+ % 65.93, normal K++ko-kültür % 67.95, yüksek K+ % 61.58, yüksek K++ko-kültür % 62.35 olarak saptandı. Ayrıca 4-6 ve 8 blastomerli aşamaya en çok normal potasyum ve normal potasyum+ko-kültür gruplarında ulaşıldığı belirlenirken (P<0.05), diğer gruplar arasında fark görülmedi. 63Yetmişikinci saatin sonunda, 8-16 blastomerli aşamaya en iyi gelişim normal potasyum grubunda belirlenirken, morula aşamasına en iyi gelişimin normal potasyum ve normal potasyum+ko-kültür gruplarında olduğu saptandı (P<0.05). Düşük ve yüksek potasyum gruplarında morulaya gelişim oranları arasındaki fark anlamlı bulundu (P<0.05). Doksan altı saatlik kültürün bitiminde, embriyoların erken blastosist ve blastosist aşamasına gelmesi beklenirken, erken blastosist ve blastosist safhasına en iyi gelişimin normal potasyum içeren medyumda şekillendiği, bunu da norma Ipotasyum+ko-kültür ve düşük potasyum gruplarının takip ettiği saptanmıştır (P<0.05). Kültürün sonunda grupların erken blastosist ve blastosiste ulaşma oranları, düşük K+ % 12.38, düşük K++ko-kültür % 16.26, normal K+ % 30.00, normal K++ko-kültür % 26.01, yüksek K+ % 11.00, yüksek K++ko-kültür % 7.20 olarak saptandı. Sonuç olarak, farklı oranlarda potasyumun, 2 hücre bloğunun aşılmasında ve cleavage oranlarında etkili olmadığı, ovidukt epitel hücreleri ile yapılan ko-kültürün embriyo gelişimini olumlu etkilediği, ancak, ko-kültürlü ortamlarda kulanılan medyumların hücrelerin ve embriyoların ihtiyaçlarını karşılaması gerektiği düşünüldü. Ayrıca blastosist aşamasına ulaşmada düşük potasyumun yüksek potasyuma göre daha faydalı olacağı, en iyi sonuçların kontrol gruplarında elde edildiği ve bu konuda ortamdaki diğer maddeleri de inceleyerek daha fazla çalışma yapılması gerektiği kanısına varıldı.

9. SUMMARY Effects of Various Potassium Levels on the Development of In Vitro Fertilized Mouse Embryos The goal of this study was to evaluate the development of embryos cultured and co-cultured in Whitten's media containing various KH2P04 levels (0.0081g/100 mL, 0.0162 g/100 ml_, 0.0324 g/100'mL), in order to cover the 2 blastomere cell block in in vitro fertilization and culture environment in pure mouse breeds. Seventy four female and 16 male BALB/C mice were used. To achieve superovulation 5 I.U PMSG and after 48 hours 5 I.U hCG were injected. Out of 1191 oocytes recovered from superovulated mice, 1071 were fertilized for 4-6 hours with semen collected from the epididymis and capacitated in TYH media for 1.5-2 hours. Fertilized oocytes were cultured for 96 hours with or without oviduct epithelial cells in low, normal (control) and high level potassium containing media. Development of cultured embryos were controlled and reported every 24 hours. During the 24 th hour of culture, the differences in cleavage rates among the groups were not important statistically. At the end of this period, embryos from all groups were at 2-6 blastomere stage. At the end of the 48 th hour cleavage rates were determined to be low K+ % 60.00, low K++co-culture % 68.71, normal K+ % 65.93, normal K++co-culture % 67.95, high K++co-culture % 62.35 respectively. Meantime 4-6 and 8 blastomere stage was mainly reached by normal potassium and normal potassium+co-culture groups (P<0.05) and no difference was observed among other groups. 65At the end of 72 nd hour, 8-16 blastomere was mostly observed in normal potassium group and morula stage was seen most in the normal potassium and normal potassium+co-culture group (P<0.05). The difference between low and high potassium groups was important (P<0.05). At the end of 96 hours culture, when the embryos were expected to reach early blastoycst and blastocyst stages, highest rates were observed in normal potassium containing medium which was followed by normal potassium+co-culture and low potassium groups (P<0.05). At the and of the culture, early blastocyt and blastocyst reaching rates of the groups were determined as low K+ % 12.38, low K++co-culture % 16.26, normal K+ % 30.00, normal K++co-culture % 26.01, high K+ % 11.00, high K++co-culture % 7.20. In conclusion, it was suggested that different potassium levels were ineffective on cleavage rates to cover 2 cell stage block, oviduct epithelial cell co-culture had beneficial effects on embryo development and co-culture media should provide the necessities of embryos. Moreover, low potassium levels were superior to higher levels and best results were obtained from the control group revealing the need to more research on the other substrates in the environment. 66