Applications using a high resolution fluorescence microscope

Abstract

Eşodaklı mikroskopi tekniği görüntü alma süresini arttırmak pahasına görüntülerinçözünürlüğünü arttırmada kullanılan bir tekniktir. Bu teknik, arka plan gürültüsünü filtrelediğiiçin geniş alanlı mikroskopi tekniğine göre daha yüksek bir çözünürlük sağlar. Buna rağmenveri alma süresinin kısa olması geniş alanlı mikroskopi tekniğini bazı uygulamalarda eşodaklımikroskopi tekniğine göre üstün kılar.Florışıl rezonans enerji geçişi (FRET), optik olarak uyarılmış molekülden (verici), bumolekülün yakının da bulunan uyarılmamış moleküle (alıcı) ışınım olmadan gercekleşenenerji transferidir. FRET verimliliginin ölçülmesi verici ve alıcı moleküllerin yerlerininnanometre mertebesinde bir netlikte (<10 nm) belirlenmesinde kullanılan güçlü bir araçtır.PMMA ince filmi içerisindeki Rhodamine B ve Fluorescein Na floresan molekülleriarasındaki enerji transferini incelemek için toplam iç yansıma ışıma mikroskopi tekniğinikullanıldı. FRET sinyalini bulabilmek için spectraFRET yönteminin adımları takip edilerek,donor molekülünden acceptor molekülüne enerji geçişi olduktan sonra, donor ışımasındakiazalmaya bakılarak FRET verimliliği hesaplandı.Eşodaklı mikroskopi tekniği kullanılarak, proteinlerin hücre içerisinde bulunduklarıyerler belirlendi. Melanopsin proteinleri hücre zarına yerleşirken, Cry proteinlerinin hücresitoplazmasına dağıldıgı gözlemlendi. Deneyler ayrıca kırmızı ışıyan protein (RFP) ileetiketlenmiş melanopsin proteini ve yeşil ışıyan protein (GFP) ile etiketlenmiş cryptochromeproteinleri ile yapıldı. Amacımız bu iki protein arasında etkileşim olup olmadığına buproteinleri etikelemekte kullanılan kırmızı ve yeşil ışıyan proteinler arasındaki enerji geçişiverimliliğine bakarak karar vermek.Son olarak, eşodaklı mikroskopi ve geniş alanlı mikroskopi teknikleri kullanılarakPMMA ince film tabakası içersinde bulunan Rhodamine B molekülünün tek moleküldavranışı gözlemlendi.

Confocal microscopy is a technique used for increasing the resolution of microscopeimages at the expense of the acquisition time. As compared with wide field microscopy,confocal microscopy provides a better resolution by rejecting out of focus fluorescent light.Despite this fact, smaller acquisition times can yield wide field microscopy superior toconfocal microscopy in certain applications.Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) is the nonradiative energy transferfrom an optically excited molecule (donor, D) to an unexcited nearby molecule (acceptor, A).Measurement of the FRET efficiency is a powerful tool in determining the relativelocalizations of the donor and acceptor molecules with nanometer (<10 nm) accuracy. Wehave used total internal reflection fluorescent microscopy to investigate the energy transferbetween two fluorescent molecules Rhodamine B and Fluorescein Na in PMMA thin films.Following the steps of spectra FRET, the efficiency of FRET was quantified by the decreasein donor intensity after energy is transferred from donor to acceptor molecule.We have used confocal microscopy to determine the exact localization of proteins incells. It was observed that the melanopsin proteins are located in cell membrane, while the cryproteins are distributed in cytoplasm of the cell. Experiments were also performed using cellscontaining both melanopsin and cryptochrome tagged with red fluorescent protein (RFP) andgreen fluorescent protein (GFP), respectively. The ultimate goal of these experiments is toobserve whether there is an interaction between these two proteins by measuring the FRETefficiency between GFP and RFP labels.Finally, we observed the single molecule behavior of Rhodamine B molecules inPMMA thin films by wide field microscopy and confocal microscopy.