Blue light dependent expression of vibrio cholerae photolyase

Abstract

Fotoliaz/kriptokrom ailesi mavi ışığı algılayan, flavin içeren proteinlerdir. Fotoliaz ve kriptokrom yapısal olarak benzemelerine rağmen, farklı türlerde değişik görevlere sahiptirler. V. cholerae bakterisi, bir fotoliaz (phr) ve iki kriptokrom (cry1, cry2) genine sahiptir. Çalışmalar Cry1 proteininin DASH ailesinde yer aldığını ve tek zincirli DNA'nın tamirinde rol aldığını göstermiştir. Yaptığımız çalışmada V. cholerae bakterisi farklı dozlarda mavi ışığa (10, 25, 50, 100, 200 µW/cm2) ve kırmızı ışığa maruz bırakıldığında, cry1, cry2 ve phr genlerinin ifadesinde ışığa bağlı artışın olup olmadığı Gerçek Zamanlı PCR metoduyla incelendi. Deneyler sonucunda fotoliaz (phr) ifadesi mavi ışıkla doza bağlı olarak artış gösterirken kırmızı ışığın hiçbir etkisi olmadı. Bu etkinin mavi ışıkla oluşan oksijen radikallerinden kaynaklanmadığını göstermek için besiyerine metilen mavisi ve hidrojen peroksit eklenerek phr ifadesine etkileri belirlendi. Sonuçlar phr gen ifadesine radikal oluşumunun etki etmediğini gösterdi. Mavi ışığa bağlı phr ifadesindeki artışın fotoliaz veya Cry1 etkisiyle mi arttığını belirlemek için cry1 genini taşıyan pMAL-c2X plazmidi V. cholerae bakterisine aktarılarak proteinin fazla ifadesi sağlandı. Yapılan çalışmada Cry1 proteininin miktarının artmasıyla mavi ışığın phr ifadesi üzerindeki etkisinin önemli bir miktarda arttığı görüldü, fakat Cry2 proteini artırıldığında bir değişim gözlenmedi. fotoliaz geninin etkisini görmek için phr geni susturulmuş hücreler ışığa maruz bırakılarak phr gen ifadesi belirlendi. Sonuçta mavi ışık etkisinin phr geni susturulmuş hücrelerde yok olduğu belirlendi. Çalışmam, V. cholerae bakterisinde, DNA tamirinin mavi ışığa bağlı olduğunu, Cry1 ve VcPhr proteinlerinin fotoliaz geninin ekspresyonunda rol aldığı, bu sayede bakterilerin kendilerini UV nedeniyle oluşan DNA hasarına karşı hazır hale getirdiklerini göstermiştir.

The photolyase/cryptochrome (phrs) family is blue-light sensing flavoproteins. Although photolyases and cryptochromes are structurally similar proteins, their functions are different depending on organisms. V. cholerae possess one photolyase and two cryptochrome genes. Photolyase (VcPhr) repairs UV-damaged DNA using energy from the blue light while Cry1, belongs to DASH family, responsible for the single strand DNA repair. In this thesis we wished to identify blue-light dependent expression of phrs genes in V. cholerae using Real-Time PCR. To this end, the cells were exposed to blue light and the quantities of cry1, cry2, phr expressions were determined. Analysis of RT-PCR results indicated that only phr expression was significantly increased when cells were exposed to blue light compared with the control samples. To see this effect is not due to the free-radical formation upon exposure cells to the blue-light, cells were subjected to the hydrogen peroxide and methylene blue and phr gene expression level was monitored by Real-Time PCR. We observed that there is no induction of phr gene expression compared with control genes that are induced under the free radicals. Next we wish to identify the gene that is responsible for induction of the expression level of phr. We performed a genome wide analysis on V. cholerae to detect possible blue-light receptors and analysis end up with three candidates, which are Cry1, Cry2, and VcPhr proteins. To see phr induction is mediated by VcPhr, Cry1 or Cry2, we first over-expressed Cry1 protein in bacteria by transferring the plasmid that carry cry1 gene, the result indicated a significant increase of phr gene compared with untransformed cells under the blue light condition. However Cry2 overexpression did not affect phr expression under the same conditions. Also to see the effect of photolyase on its own expression, similar experiments were performed on phr knockout V. cholerae. We did not observe a significant induction of phr gene by blue light when there is no functional VcPhr protein in the cell. All these results suggest that both VcPhr and Cry1 are involved in the induction of phr expression under blue light. The present study shows blue light dependency of repair activity in V. cholerae and it is possible that Cry1 and VcPhr take role in induction of phr expression and make cells ready to repair DNA damage, caused by UV light.