Investigation of real time DNA repair via surface plasmon resonance (SPR)

Abstract

UV ışığına maruz kalan canlıların DNA yapısında büyük değişimler görülebilir. Siklobütan primidin dimerlerin (CPD) ve 6-4 lezyonlarının oluşumu bu değişimlerin en sık gözlemlenenleridir. Bir flavoprotein alt ailesine ait olan CPD I ve II fotoliaz enzimleri DNA üzerinde UV ışığı ile hasar görmüş bu bölgelere spesifik bağlanarak, hasarlı bölgelerin tamirini üstlenir. Mavi ışık enerjisini kullanarak tek zincrili ve çift zincirli DNA'ların UV-hasarlı bölgelerini tamir eden bu protein ailesine akraba olan kriptokromlar ise DNA tamirinden çok, bitkilerde ışık reseptörü, memelilerde ise sirkadiyan saatin önemli bir bileşeni olarak metabolizma içinde görev alır. Bu bilgiye rağmen, oldukça yeni keşfedilen bir kriptokrom çeşidinin de UV ışığı ile hasarlanmış tek zincirli DNA'yı fotoliaz enzimi gibi tamir edebildiği gözlemlenmiştir. CRY-DASH adı verilen bu protein henüz yeterli miktarda araştırmaya konu olmamıştır. Bu tezde, tek zincirli ve çift zincirli DNA'nın CRY-DASH ile etkileşimi, tamir süreci Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) adı verilen bir teknik yardımı ile incelenmiş olup, bu etkileşimin DNA-fotoliaz enzimi etkileşimi ile karılaştırması yapılarak CRY-DASH'in DNA'ya bağlanma etkinliği ölçülmüştür. SPR sayesinde CRY-DASH'in ve fotoliaz'ın DNA anlık bağlanması, bu bağlanmanın spesifikliği kinetik parametrelerin de hesaplanması ile görülmüştür. Bu çalışma DNA üzerindeki lezyonların tamirini SPR yöntemi ile göstermesi açısından önemlidir.

DNA structure can be greatly affected by UV light exposure. The cyclobutane prymidine dimer (CPD) and 6-4 lesion formations along with the specific breaks on strands are the most common type of DNA damage caused by UV irradiation. Specific to UV-damaged DNA, CPD photolyase I and II construct two subfamilies of flavoproteins, and they have recognition and repair capabilities of CPD sites on both single stranded (ssDNA) and double stranded (dsDNA) DNA with the aid of blue light energy. The other types of flavoprotein family consist of cryptochromes (CRY), and the most commonly known types act as photoreceptors in plants, or circadian rhythm regulators in animals, but lack photorepair activity. Recently, it has been found that a specific type of cryptochrome also has photorepair activity on ssDNA. This protein, called cryptochrome-DASH (CRY-DASH), is yet to be studied for its binding to DNA with newly developed techniques. In this thesis, CRY-DASH-DNA interaction was investigated using Surface Plasmon Resonance (SPR) which is a common assay to characterize protein-DNA or protein-protein interactions. Next, interaction of UV damaged and undamaged DNA with CPD photolyase was then examined and compared with the interaction of damaged/undamaged DNA and CRY-DASH. SPR shows the immediate molecular binding of DNA to the surface and confirms the specific binding of photolyase and CRY-DASH with UV treated or UV untreated DNA by providing kinetic constants of binding. This study is significant for investigation of repair of lesions in the DNA structure using SPR.