Identification of important residues for modulation of allosteric properties of potato ADP glucose pyrophosphorylase

Abstract

ADP-glikoz pirofosforilaz (AGPaz), allosterik enzim olma özelliğiyle karbon akışını kontrol eden, bakterilerde glikojen; bitkilerde nişasta sentezinde görev alan anahtar bir düzenleyici enzimdir. Bakteri AGPaz'ı tek alt birimden oluşmasına rağmen, bitki AGPaz'ı farklı görevli alt birimler içerip heterotetramer (?2ß2) yapıdadır. Büyük alt birim (LS), katalitik olan küçük alt birimle (SS) etkileşerek allosterik düzenlemede görev alır. LS, SS'in katalitik aktivitesini, heterotetramerik enzimin allosterik regülatör cevabını artırarak düzenler. Bitki hücresinde AGPaz'ın kararsız halde bulunduğu bilinmektedir. Önceki çalışmalarda patates AGPaz'ının heterotetramerik modelinde küçük alt birimle etkileşen büyük alt biriminin önemli aminoasitleri hem deneysel hem de hesaplamalı olarak belirlenmiştir. Bu çalışmada amaç ters genetik yaklaşımı ile, patates AGPaz enziminin heterotetramer oluşumunu artırmak ve alt birimlerin birbirleriyle olan etkileşiminin enzimin allosterik düzenlenmesini etkileyip etkilemediğini araştırmaktır. Bu nedenle heterotetramerik enzim oluşturamayan LSR88A mutantı rastgele mutasyona tabi tutulmuş ve SS içeren glgC- E.coli hücresinde (AGPaz akitivitesi olmayan) glikojen üretimini geri kazananların iyot buharı ile boyama yöntemiyle seçilmesi amaçlanmıştır. 15 baskılayıcı mutant seçilmiş ve mutantların sekans analizi mutasyonların bir kısmının alt birim ara yüzünde meydana geldiğini göstermiştir. Bir sonraki aşamada, seçilen mutantlarda R88A mutasyonunun varlığında veya yokluğunda heterotetramer oluşumunun artıp artmadığına bakmak için R88A mutasyonu, bölgeye yönlendirilmiş mutajenez ile geri çevrildi. RM2 ve RM10 mutantlarının kinetik karakterizasyonu bu mutantların yabanıl tip enzime göre farklı allosterik özelliklere sahip olduğunu gösterdi. Bu sonuçlar büyük alt birim ve küçük alt birim arasındaki ara yüzün AGPaz enziminin allosterik özellikleri için önemli olduğunu göstermektedir. Daha karalı ve daha iyi regüle olan AGPaz varyantlarını elde etmek, bu mutantların bitkilerdeki nişasta miktarını artırmak için kullanılmasını sağlayacaktır.

ADP glucose pyrophosphorylase (AGPase) is a key regulatory enzyme of bacterial glycogen and plant starch synthesis as it controls carbon flux via its allosteric regulatory behavior. Whereas the bacterial enzyme is composed of a single subunit type, the plant AGPase is a heterotetrameric enzyme (?2ß2) with distinct roles for each of the two subunit types. The large subunit (LS) is involved mainly in allosteric regulation through its interaction with the catalytic small subunit (SS). Previously, critical amino acids of potato (Solanum tuberosum L.) LS that interact with SS in the native heterotetramer structure were identified both computationally and experimentally. In this study, we aimed to improve the heterotetrameric assembly of potato AGPase and to detect residues located on the interface involving the allosteric regulation of the enzyme with a reverse genetics approach. A mutant, ?2ß2 formation deficient, large subunit of potato AGPase named LSR88A was subjected to random mutagenesis using error prone PCR and screened for the capacity to form an enzyme restoring glycogen production in glgC- Escherichia coli, AGPase activity deficient, containing wild type SS by assessing iodine staining. Fifteen suppressor mutants were identified and sequence analysis of these mutants revealed that mutations are mainly clustered at subunit interface and nearby the subunit interface. Subsequently, R88A mutation was reversed with site directed mutagenesis to see the effect of these mutations in the absence of R88A mutation. Kinetic characterization showed that two random mutants, named RM2 and RM10, exhibit altered allosteric properties than the wild type. These results indicate that interfaces between the large and small subunits are significant for the allosteric properties of the AGPase. Obtaining stable and up-regulated AGPase variants will enable us to use these mutants to increase the starch yield in crop plants.