Structural and functional analysis of perforin mutations in association with clinical data of familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 2 (FHL2) patients

Abstract

Bağışıklık sistemi, vücudun hastalık yapıcı etkenlere ve tümör hücrelerine karşı savunma mekanizmasıdır. Çoklu işlevsel alt gruba sahip por oluşturucu bir protein olan perforin, bağışıklık sisteminde sitotoksik etkiye sahip efektör bir molekül olarak anahtar bir rol oynar ve T-lenfositleri ile doğal öldürücü hücreler tarafından granüller içerisinde salgılanır, bu granüller aynı zamanda programlı hücre ölümüne neden olan granzim B'yi de içerir. Granzim B ile sinerji oluşturan perforin, yok edilmek üzere hedeflenmiş virüsle enfekte olmuş ya da transformasyona uğramış hücrelerin hücre zarında por oluşturacak şekilde görev yapar. Perforinde gözlenmiş çok sayıda mutasyon bu mekanizmayı bozarak nadir görülen fakat ölümcül olan Ailevi Hemofagositik Lenfohistiositoz tip 2 (FHL2) hastalığına yol açar. FHL2 şu karakteristik özellikleriyle bilinen otozomal çekinik bir hastalıktır: ateş, karaciğer ve dalağın büyümesi, kan hücrelerinin sayıca azalması, kandaki ferritin miktarının artması, trigliserid miktarının artması ve/veya fibrinojen miktarının azalması, düşük doğal öldürücü hücre aktivitesi, yüksek CD25 seviyesi ve hemofagositoz. Biz bu çalışmada, tasarladığımız bir öncül-por modeline dayanarak FHL2 hastalığına ilişkin 76 yanlış anlam mutasyonunun kapsamlı bir yapısal analizini rapor ediyoruz. Modelimizde, perforin monomerleri daha önce bulunmuş deneysel kısıtlarla tutarlı ve çevrimsel simetriye sahip bir şekilde oligomer oluşturmaktadır, üstelik model por çapında ve içerdiği monomer sayısında esnekliğe sahiptir. Mutasyonların model üzerinde kümelenmesi perforinin üç farklı işlevsel bölgesinin haritasını çizmektedir. Kararlılık değişimi hesaplamaları mutasyonların çoğunlukla protein yapısının kararlılığını bozduğunu göstermektedir, bununla birlikte ilginçtir ki, sıkça polimorfizm olarak öne sürülen A91V değişimi, daha kararlı bir protein yapısına yol açmaktadır. Mutasyonların yapısal özellikleri perforin eksikliği görülen hastalarda şiddetli işlevsel bozukluklar görülmesini açıklamaya yardımcı olmaktadır. Bizim bu çalışmamız, perforinin oligomer oluşturması üzerindeki mutasyon etkilerine ve FHL2 hastalarının bozulmuş sitotoksik işlevlerine yapısal bir yaklaşım sağlamaktadır.

The immune system is the defense mechanism of the body against pathogenic agents and tumor cells. Perforin, a multi-domain pore-forming protein, plays a key role in the immune system as a cytotoxic effector molecule secreted by T-lymphocytes and Natural killer (NK) cells within granules, which also contain granzyme B that induces apoptosis. In synergy with granzyme B, perforin acts via pore formation at the cell membrane of virus-infected and transformed cells that are targeted to be eliminated. A vast number of observed mutations in perforin impairs this mechanism resulting in a rare but fatal disease, familial hemophagocytic lymphohistiocytosis type 2 (FHL2). FHL2 is an autosomal recessive disorder characterized by fever, hepatosplenomegaly, cytopenia, hyperferritinemia, hypertriglyceridemia and/or hypofibrinogenemia, decreased NK cell activity, increased CD25 level and hemophagocytosis. Here we report a comprehensive structural analysis of a collection of 76 missense perforin mutations associated with FHL2 based on a proposed pre-pore model. In our model, perforin monomers oligomerize having cyclic symmetry in consistent with previously found experimental constraints yet having flexibility in the size of the pore and the number of monomers involved. Clusters of the mutations on the model map to three distinct functional regions of the perforin. Stability change (??G) calculations show that the mutations mainly destabilize the protein structure, interestingly however, A91V change, often suggested as a polymorphism, leads to a more stable one. Structural characteristics of mutations help explain the severe functional consequences on perforin deficient patients. Our study provides a structural approach to the mutation effects on the perforin oligomerization and impaired cytotoxic function in FHL2 patients.