Investigations of the structure function relationship of cryptochrome in unicellular organisms

Abstract

Işık algı reseptörleri canlıların çevreden ışık bilgisini almakla görevlidirler. Doğada gerçekleşen ışık değişimlerine göre canlılar kendilerini adapte edip, metabolizmalarını optimize ederler. Fotoliyaz /Kriptokrom genleri DNA tamiri ve mavi ışık reseptörü olarak çalışan geniş ve farklılaşmış bir gen ailesidir. Bu aile yaygın olarak yaşamın üç alemindeki canlılarda bulunur. Üç ana kategoriden oluşan bu aile; 1) Siklobütan pirimidin dimer fotoliyaz (CPD-Fl), 2) [6-4] fotoliyaz ([6-4] Fl) ve 3) kriptokrom (Kri) proteinlerinden oluşur. Fotoliyazlar ışık enerjisini kullanarak DNA üstündeki ultraviyole ışının yarattığı hasarları tamir eden enzimlerdir. Buna karşın kriptokromlar, bitki ve hayvanlarda sirkadyen ritmi düzenlemek gibi çeşitli biyolojik olayları kontrol eden sinyal molekülleri olarak çalışırlar. Yüksek canlılarda fonksiyonları tanımlanmış olsa da kriptokromların tek hücreli canlılardaki rolleri belirli değildir. Evrimsel açıdan bakıldığında, basit canlılardaki kriptokromlar bitki ve hayvanlardaki kriptokromların atası olabilme ihtimalini taşımaktadırlar. Sonuç olarak, fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait genleri kodlayan tek hücreli genomlarından bu aileye ait yeni proteinler keşfetmek kriptokromun yapı-işlev ilişkisini ve farklı canlılarda farklı fonksiyonlara sahip olabilmesinin altında yatan yapısal değişiklikleri anlamak açısından önem taşır. Bu amaçla, bu tezde tek hücreli canlılarda bulunan kriptokromlar yapı-işlev ve kinetik ilişkisi yönünden biyokimyasal, komplementasyon ve yüzey plasmon rezonans spektroskopi yöntemleri kullanılarak incelenmiştir. Bu çalışmada, bir kırmızı alg olan Cyanidioschyzon merolae'ye ait fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait yedi tane yeni gen tanımlanmıştır. Evrimsel sınıflandırmada kırmızı alge ait fotoliyaz benzeri bu genlerden bir tanesi [6-4] fotoliyaza benzerlik gösterir. Üç tanesi tek zincir DNA üstündeki UV ışın hasarlarını tamir eden ve kriptokromun alt bir grubu olarak sayılan KRİ-DASH proteinleriyle aynı ailedendirler. Bunun yanında iki tane genin bitki kriptokromlarıyla ve bir tanesinin de bitki kriptokromuyla fotoliyaz arasında bağımsız olarak evrimleştiği belirlenmiştir. Biyokimyasal ve komplementasyon verileri C. merolae'nin iki tane işlevsel Kri-DASH proteinine ve bir tane de DNA tamir işlevi olmayan Kri-DASH'e sahip olduğunu kanıtlamıştır. Fotoliyaz/kriptokrom ailesine ait olan ve ilkel bir canlıda bulunan bu yeni fotoliyaz benzeri genler için yapılan böyle bir fonksiyonel karakterizasyon çalışması, bitki kriptokrom ailesinin ilk ökaryotlardan itibaren oluşumuna, orijinine ve evrimine ışık tutma açısından önemlidir. İkinci olarak, bu tezde V.cholerae Kriptokrom-DASH ve V.cholerae Fotoliyaz enzimlerinin DNA tamiri kinetiği yüzey plazmon rezonans spektroskopisi ile incelenmiştir. Bildiğimiz kadarıyla ilk defa bu çalışmayla V.cholerae Kriptokrom-DASH'in siklobutan pirimidin dimer içeren tek zincir ve çift zincir DNA'ya olan bağlanma isteği sayısal olarak ölçülmüştür. Buna ek olarak, DNA tamir deneylerinin, yine bu çalışmada, yüzey plazmon rezonans spektroskopisi tekniği ile gerçek zamanlı olarak gözlenebildiği gösterilmiştir

Photoreceptors allow living organisms to gain information about their external world and thus adapt themselves and optimize their metabolism to changes in the nature. The photolyase/cryptochrome (Phr/Cry) family is a large and diversified gene family that encodes DNA repair enzymes and blue-light photoreceptors. They exist widespread in three kingdoms of life. There are 3 major categories of proteins represented by this family: 1) The cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) Phr, 2) the [6-4] Phr, and 3) the cryptochromes (Cry). Photolyases are enzymes that utilize light energy for repair of UV lesion on DNA. Cryptochromes, in contrast, function as signaling molecules that regulate diverse biological responses such as entrainment of circadian rhythms in plants and animals. Nevertheless, the role of the Crys is ill-defined especially in unicellular organisms. From the evolutionary point of view, the Crys in such lower organisms hold the potential to be the ancestors of animal and plant cryptochromes. Hence, identification of new members of Phr/Cry family encoded by the genomes of different unicellular organisms is important to understand functional diversity of Cry family and also to know how structure influences cryptochrome function. Towards this aim, this dissertation concentrates on the analysis of structure-function and kinetics of cryptochromes in unicellular organisms via biochemical complementation and SPR spectroscopy methods. Here, seven new members of the PHR/CRY family of a red algae Cyanidioschyzon merolae were identified. Evolutionary relationships of algal Phr-like genes revealed that one gene is close to the [6-4] photolyase, three to the single strand DNA repairing subfamily of cryptochromes; called Cry-DASHes. Also, two plant type cryptochromes and one blue light photoreceptor as an independent clade between photolyase and plant type cryptochrome were found. Both, biochemical and complementation data provide evidence that C. merolae harbors two functional Cry-DASHes in addition to the one without DNA repair property. Functional characterization of photolyase/cryptochrome family from such a primitive algae provides insights into the evolution and the origin of plant cryptochrome lineages back to early eukaryotes. Secondly, the repair kinetics of a VcCry-DASH and a VcPhr were investigated using Surface Plasmon Resonance (SPR). To our knowledge for the first time, we quantified the affinity of VcCry-DASH to ssDNA and dsDNA containing CPD UV lesion. Moreover, we showed that DNA repair assays can be made by SPR spectroscopy by real time monitoring DNA repair.?