Molecular analysis of protocadherins in mammalian cells

Abstract

Cadherin proteinleri hücre-hücre adezyonunda görev alan büyük bir transmembran protein ailesidir ve protocadherinler bu ailenin en büyük alt grubudur. Cadherinler iyi çalışılmış olsa da protocadherinler hakkındaki bilgi kısıtlıdır. Protocadherinlerin hücre adezyonunda rol aldığı gösterilmiştir ve nöron tanımlanmasında moleküler işaretçi oldukları düşünülmektedir. Ayrıca, yakın zamanda yapılan çalışmalar protocadherinlerin kanser ve nörolojik hastalıklarla ilişkisini açığa çıkarmıştır. Bu çalışmada biz hücre döngüsüne dayalı hücresel yerleşim gösteren bir protocadherini karakterize etmeyi amaçladık. Araştırdığımız protocadherinin çeşitli mutant versiyonlarını ürettik ve fizyolojik ve mutant proteinlerin hücresel lokasyonlarını hücre döngüsü boyunca mikroskop ile takip ettik. Ayrıca, sitoplazmik domainin, protenin hücre döngüsüne bağlı yerleşiminin kontrolündeki rolünü araştırdık. Sitoplazmik domainin etkilşim partnerlerini tanımlamak için iki doğrudan yöntem kullandık: 1. GST-füzyon afinite kromatografisini takiben kütle spektroskopisi; 2. BioID metodu (yakınlık-bağımlı biyotin tanımlamanın biyotin-streptavidin afinite kromatografisi ve kütle spektroskopisiyle kombinasyonu). Bu iki deneysel strateji protocadherinin aday etkileşim partnerlerini keşfetmemizi sağladı. Ek olarak, boncuk öbekleşme deneyi gerçekleştirdik. Çalıştığımız spesifik protocadherinin homofilik adezyon aktivitesi olmadığını gösterdik. Bu araştırma projesi protocadherinler hakkında yeni bilgiler ortaya koydu ve protocadherinlerin kanser tanı ve tedavisinde kullanılabilme potansiyelini gösterdi.

Cadherins are a big family of transmembrane, cell-cell adhesion proteins and protocadherins constitute the largest subgroup of cadherins. Although cadherins are extensively studied, less information is available about protocadherins. Protocadherins have been shown to function in cell adhesion and they are thought to be the molecular markers of neuronal identity. Also, recent studies revealed the involvement of protocadherins in cancer and neurodegenerative diseases. We aimed to characterize a protocadherin, which showed a cell cycle dependent subcellular localization. We generated various mutant versions of the protocadherin and analyzed subcellular localizations of wild type and mutated proteins throughout the cell cycle using microscopy. We also investigated the role of the cytoplasmic domain in regulation of cell cycle dependent localization of the protein. In order to identify the interaction partners of the cytoplasmic domain, we used two orthogonal approaches: 1. GST-fusion pull-down assay followed by mass spectrometry; 2. BioID method (proximity-dependent biotin identification combined with biotin-streptavidin affinity chromatography and mass spectrometry). These two experimental strategies helped us to discover interaction partner candidates of the protocadherin. Furthermore, we performed bead aggregation assay. We demonstrated that the protocadherin that we studied does not have homophilic adhesion activity. This research project produced novel knowledge about the protocadherins and showed the promise of protocadherins to be used in cancer diagnosis and treatment.