Glutamic acid 358 is important for the normal allosteric function and heterotetramer formation of potato adp-glucose pyrophosphorylase

Abstract

ADP-glükoz pirofosforilaz (AGPaz) bitki nişasta biyosentezinde rol alan anahtar bir enzimdir. Enzimin iki farklı gen tarafından kodlanan büyük (LS) ve küçük (SS) alt birimleri vardır. Deneysel ve hesaplamalı çalışmalar patates AGPase alt birimleri arası yüzey amino asitlerinin etkileşimlerinin, allosterizm için önemli olduğunu göstermiştir. Belirlenen amino asitler arasından; LS A91, F101, F311 ve E358?in (hataya yatkın PCR vasıtasıyla tanımlanmıştır) patates AGPazının allosterik ve katalitik özellikleri etkilediği bulunmuştur. Bu çalışmada, bu mutasyonların patates AGPazının heterotetramer oluşumu ve allosterik ve katalitik özelliklerine etkisi incelenmiştir. Tüm mutasyonlar, vahşi tip (WT) patates AGPase büyük alt birimi cDNA?sına noktasal mutasyon PCR?ı ile uygulanmıştır. WT-LS ile mutant LS?ler, glikojen üretiminde yetersiz olan E.coli glgC (patates SS cDNA?sını içeren) hücrelerine transform edilmiştir. LS-E358G dışındaki tüm LS mutantları E.coli glgC-hücrelerini tamamlamıştır. LS-E358G mutasyonunu, katalitik, allosterik ve yapısal özelliklere etkisini anlamak amacıyla, ayrıntılı biyokimyasal karakterizasyonu tabi tutulmuştur. Mutant AGPaz LS-E358G?nin daha fazla heterotetramere ve daha az monomere ve dimere sahip olduğu gözlenmiştir. WT AGPase ile karşılaştırıldığında, mutantın allosteric ve katalitik özellikleri belirgin biçimde değişmiştir. Mutantın aktivatörüne afinitesine azalmış ve inhibitör yönelik afinitesi artmıştır. İlginç bir şekilde, patates AGPase LS daha çok düzenleyici olarak rol almasına rağmen, bu mutasyonun patates AGPase enziminin katalitik performansını etkilediği bulunmuştur. Ters ve ileri yön aktivite deneyleri ATP ve ADP-glükoz olan afinitenin azaldığını belirlemiştir.

ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) is a key enzyme in plant starch biosynthesis. It contains large (LS) and small (SS) subunits encoded by two different genes. Experimental and computational studies indicated that interfacial amino acids in potato AGPase are important for the subunit-subunit interactions and allosterism. Among identified amino acid residues; A91, F101, F311 and E358 on LS (identified through error prone PCR) was found to be potent for influencing the allosteric and the catalytic properties potato AGPase. In this study, effect of these mutations on heterotetramer assembly and allosteric and catalytic properties of potato AGPase were investigated. All mutations were applied on to wild type (WT) potato AGPase large subunit cDNA using site directed mutagenesis PCR. Mutants LS, together with WT-LS, was transformed to E.coli glgC- containing the potato SS cDNA plasmid, that are deficient in glycogen production. All the LS mutants except LS-E358G were able complement glgC- in E.coli. LS-E358G mutant subjected to the detailed biochemical characterization to investigate its catalytic allosteric and structural properties. Compared to WT AGPase, AGPase with mutant LS-E358G was found to have a different assembly profile, having more heterotetramers and less monomers and dimers. Its regulatory properties were noticeably altered, its affinity towards its activator reduced and inhibitor increased. Interestingly, although large subunit of potato AGPase is mostly regulatory, this mutation considerably reduced the affinity of the AGPase towards its reverse and forward direction substrates ATP and ADP-glucose, showing potato tuber AGPase large subunit affects the catalytic performance of enzyme.