The mitochondrial toxin ethidium bromide also causes genotoxicity in the nucleus

Abstract

Mitokondri, oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretilmesi, hücre sinyallerinin iletilmesi ve apoptoz gibi birçok hücresel tepkimede görev alır. Bu organellerin bakteri olan atalarından kalan ve mitokondrinin işlevselliğinde önemli bir yere sahip genomları (mtDNA) vardır. Hasarlı mtDNA hastalıklara yol açabilir ve yaşlanmada önemli bir rolü olabilir. Bu tezde, tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae?yi kullanan mtDNA araştırmaları üzerine iki çalışma yer almaktadır.Ana çalışmamız mitokondriyal toksin etidyum bromürün (EtBr) hücredeki etkileri üzerinedir. EtBr, S. cerevisiae?de mtDNA?nın hızlı yıkımına sebep olurken, diğer organizmalarda da mtDNA?nın kaybına sebebiyet vermektedir. Neredeyse 50 yıl boyunca, EtBr?nin sadece mtDNA?yı etkilediği, nükleer DNA?ya zarar vermediği düşünülmüştür. Ancak biz EtBr?nin etkilerinin aslında bir tek bu organelle sınırlı olmadığını gösterdik. Hücre çekirdeğindeki çift zincir DNA kırıklarının tamirini gerçekleştiremeyen mutantların, mtDNA?ya ya da mtDNA?nın kodladığı proteinlere sahip olmadığı halde, EtBr?ye duyarlı olduğunu bulduk. EtBr?nin hücre çekirdeğindeki toksik etkisinin, özgün gen dönüşümü testimizle ölçüldüğü üzere, genomik kararsızlıkta artışa neden olduğunu gösterdik. Bulgularımızın, yaygın olarak kullanılan bu kimyasalla yapılan deneylerin tasarım ve yorumlanmasında önemli bir etkisi olacaktır.Ek çalışmalarda, mitokondrinin bölünmesinde görev alan yeni proteinleri aramaktayız. Mitokondri devamlı bölünmekte ve birleşmekte ve mitokondriyal dinamikleri bozan mutasyonlar mtDNA?nın kalıtımını ve korunmasını etkilemektedir. Mitokondri bölünebildiğinde yaşayamayan bir maya suşu yarattık. Akabinde, fazla ifade edildiğinde muhtemelen mitokondrinin bölünmesinde görev alan proteinin komplekslerinin stokiyometrilerini ya da regülasyonlarını bozarak, bölünmenin engellenmesine yol açacak genleri aradık. Mitokondriyal bölünmenin yeni bileşenlerini aramada geldiğimiz nokta da bu tezde yer almaktadır.

Mitochondria take part in many cellular events, such as ATP generation by oxidative phosphorylation, cellular signaling, and apoptosis. These organelles contain a genome (mtDNA), inherited from a bacterial progenitor, which plays a major role in mitochondrial function. Damage to mtDNA can cause disease and may play a causal role in aging. In this thesis, we have engaged in two studies related to the study of mtDNA using the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.Our major focus was on the cellular effects of the mitochondrial toxin ethidium bromide (EtBr). EtBr rapidly causes the destruction of mtDNA in S. cerevisiae and also engenders mtDNA loss in other organisms. For nearly fifty years, it has been suggested that EtBr solely affects mtDNA, leaving the nuclear DNA unscathed. However, we have now demonstrated that the effects of EtBr are, in fact, not limited to that organelle. We found that mutants lacking the ability to repair double-stranded DNA breaks in the nucleus are acutely sensitive to EtBr, even when mtDNA products or mtDNA itself are already lacking. We demonstrated that this toxic effect of EtBr in the nucleus causes an increase in nuclear genomic instability as measured by a novel assay of gene conversion. Our findings will have a major impact on the interpretation and design of experiments using this commonly used reagent.In additional studies, we are seeking new proteins involved in mitochondrial division. Mitochondria constantly fuse and divide, and mutations perturbing mitochondrial dynamics affect the segregation and maintenance of mtDNA. We created a yeast strain that is inviable when mitochondria are able to divide. Subsequently, we are seeking genes that when overexpressed would potentially alter the stoichiometry or regulation of complexes involved in mitochondrial division, leading to a block in this process. I will discuss our progress so far in seeking novel mitochondrial division components.